А.              РОЛЬ АНТИБИОТИКА В ТРАНСФОРМАЦИИ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ИЗ ВОСПРИИМЧИВОЙ В УСТОЙЧИВУЮ
В процессе удвоения генетического материала могут происходить ошибки репликации, приводящие к изменению генетической информации микроорганизма. Такие модификации называ-
ют мутациями. Некоторые мутации могут сообщать микроорганизму устойчивость к антибиотику, к которому дикий тип был восприимчив. Мутации, приводящие к устойчивости, обычно происходят с очень низкой частотой, ~ 10~~7—10~9, н, следовательно, доля устойчивых клеток в бактериальной популяции всегда очень невелика. Однако, если популяция растет is присутствии антибиотика, рост восприимчивых бактерий подавляется, а устойчивые продолжают размножаться. В конце концов большую часть популяции будут составлять устойчивые бактерии. В таких случаях говорят, что антибиотик «отобрал» устойчивые формы. Появление и распространение бактериальной популяции, устойчивой к антибиотикам, является результатом совместного действия мутаций и отбора. Можно экспериментально показать, что антибиотик действует только как «селектирующий агент», но не как мутаген. Действительно, частота появления устойчивых бактерий в восприимчивой популяции не зависит от наличия или отсутствия антибиотика. Другими ело-, вами, устойчивые мутанты могут возникать в бактериальной популяции до контакта популяции с антибиотиком. Разные ис
следователи использовали разные экспериментальные подходы для демонстрации этого факта. Упрощенный пример такого эксперимента представлен и объяснен на рис. 4.1.
Б. ПЕРЕНОС ИНФОРМАЦИИ ОБ УСТОЙЧИВОСТИ ОТ ОДНОЙ БАКТЕРИИ К ДРУГОЙ
Мутантный штамм, устойчивый к данному антибиотику, может при определенных условиях передать информацию об устойчивости восприимчивому штамму, в результате чего последний становится устойчивым и в свою очередь может передавать информацию об устойчивости новым клеткам (рис. 4.2). Генетическую информацию об устойчивости может нести одна из двух молекул: или ДНК бактериальной хромосомы, или небольшие ДНК в цитоплазме — плазмиды. Соответственно устойчивость называют хромосомной и внехромосомной (табл. 4.2).
•Таблица 4.2. Механизмы передачи устойчивости
Хромосомная устойчивость
Внехромосомная устойчивость
Конъюгация:              контакт              между бактериальными
клетками и перенос генетического материала
Трансдукция: перенос фрагментов генома от бактерии-донора к бактерии-реципиенту в результате заражения последней бактериофагом, выросшим в бактерии-доноре
Трансформация: перенос фрагментов ДНК от донора к реципиенту
R-факторы грамотрицательных организмов переносятся при конъюгации. Плазмиды грампо- ложительпых организмов переносятся прп траисдукции
В.              ХРОМОСОМНАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ
Участки хромосомы могут переходить от одной бактерии к другой с помощью трех механизмов: конъюгации, трансдукцпи и трансформации.

1. Конъюгация происходит в том случае, когда имеется физический контакт между двумя клетками п часть ДНК может перейти из одной бактериальной клетки в другую, До перехода ДНК бактерни-донора реплицируется. Проникнув в реципнент- ную клетку, ДНК донора может обмениваться гомологичными участками с ДНК этой клетки. Если перенесенный участок содержит генетический детерминант устойчивости к антибиотику, как бактерия-донор, так и бактерия-реципиент будут устойчивыми.
2. Трансдукцией называют перенос фрагментов ДНК из одной бактерии к другим с помощью бактериофага. Фаг инфицирует

бактерию, захватывает фрагмент бактериальной ДНК и включает его в собственную ДНК. Затем он реплицируется (реплика содержит также участок бактериальной хромосомы), лизирузт клетку-хозяина и инфицирует другие бактерии. Если включенный участок ДНК содержит детерминанты устойчивости к антибиотику, результатом трансдукции будет передача устойчивости от одной бактерии ко многим другим.

3. Трансформация заключается в освобождении из бактерии в окружающую среду ДНК и включении ее в другую бактерию. Роль этого явления в передаче устойчивости у бактерий изучена недостаточно. По-видимому, трансформация не очень важна для передачи устойчивости.
   

Г. ВНЕХРОМОСОМНАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ
Генетический материал у бактерий может содержаться не только в хромосомах, но и в цитоплазме в составе плазмид, что придает этим бактериям определенные свойства.

1. R-ФАКТОРЫ

Устойчивость к антибиотикам сообщают бактериям определенные плазмиды, названные R-факторами.
а.              Доказательство существования R-фактора
Первые предположения о существовании внехромосомпого фактора, ответственного за множественную устойчивость и способного передавать устойчивость другим бактериям, были высказаны на основании некоторых эпидемиологических и экспериментальных данных. В 1959 г. исследование эпидемии бациллярной дизентерии в Японии подтвердили это предположение. После лечения антибиотиком больные, которые сначала выделяли с испражнениями восприимчивые бактерии, позже начали выделять бактерии, устойчивые к четырем разным антибиотикам (множественная устойчивость). Объяснить появление множественной устойчивости за счет мутации очень трудно. Спонтанные мутации, приводящие к устойчивости к одному антибиотику, возникают с частотой около 10~8. Частота появления четырех независимых мутаций, сообщающих устойчивость к четырем разным антибиотикам, составит 10"8•10~8•10~8•10~8=10~!2, т. е. будет чрезвычайно мала. Бактерии, обладающие множественной устойчивостью, выделенные во время эпидемии в Японии, были очень многочисленными и появились слишком быстро после начала лечения антибиотиком, чтобы множественная устойчивость могла возникнуть заново. Кроме того, почему используемый антибиотик должен отбирать бактерии, обладающие множественной устойчивостью? Поскольку бактерии, устойчивые только к одному антибиотику, появляются с большей частотой, чем бактерии с множественной устойчивостью, бактериальная популяция должна быть представлена в основном штаммами, устойчивыми только к тому антибиотику, который является селектирующим агентом.
Когда штаммы бактерий с множественной устойчивостью, выделенные от больных, которых лечили антибиотиком, смешали в пробирке с восприимчивыми бактериями, оказалось, что восприимчивые бактерии приобрели множественную устойчивость. К тому времени было известно, что хромосомные гены, ответственные за устойчивость к четырем данным антибиотикам, расположены в разных участках хромосомы. Поэтому их одновременный перенос потребовал бы переноса почти всей
хромосомы. В природе этого никогда не происходит, поскольку при конъюгации, трансдукдии и трансформации переносятся только небольшие фрагменты хромосомы. Было высказано предположение, что гены устойчивости к четырем антибиотикам не идентичны хромосомным генам и расположены во внехромосом- ной ДНК — плазмиде, способной передаваться от одной бактерии к другой. Такие плазмиды назвали R-факторами.
б.              Физическая и генетическая природа R-факторов
R-факторы были исследованы классическими методами молекулярной биологии. Было показано, что они представляют собой двухцепочечную ДНК в форме ковалентно замкнутых колец с мол. массой около 10®—108. Помимо своего основного свойства—сообщать клетке бактерии-хозяина устойчивость к антибиотикам— R-факторы имеют другие особенности: их размножение может происходить без включения в бактериальную хромосому, т. е. они являются самореплицирующимися единицами. Репликация R-факторов координирована с репликацией хромосомы, поскольку они присутствуют в клетке в соотношении 1 : 1 с хромосомой. Они являются трансмиссивными, т. е. могут передавать копию в реципиентную бактерию (рис. 4.2).
R-факторы состоят из 1) фактора, ответственного за репликацию и передачу и называемого фактором передачи устойчивости (RTF), и 2) нескольких детерминантов устойчивости. Некоторые участки R-факторов могут отделяться и независимо существовать в цитоплазме бактерий.
в.              Распространенность R-факторов
R-факторы обнаружены у многих видов грамотрицательных бактерий, особенно у энтеробактерий (кишечные бактерии желудочно-кишечного тракта млекопитающих). Они могут передаваться бактериям разных видов, например от Escherichia coli к Shigella и наоборот, присутствуют как в патогенных, так и в непатогенных организмах. Следовательно, их можно обнаружить в нормальной кишечной флоре, которая может служить «хранилищем» устойчивости и передавать R-факторы патогенным бактериям (Shigella, Vibrio, Klebsiella, Proteus, Pasteurel- la, Haemophilus и т. д.).

2. ПЛАЗМИДЫ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ

У грамположительных бактерий (например, гноеродных кокков, таких как стафилококки, стрептококки, диплококки) имеются плазмиды, близкие R-факторам грамотрицательных организмов. Они могут передаваться от одной бактерии к другой бактериофагом в процессе, сходном с трансдукцией. Типы и механизмы устойчивости к наиболее известным антибиотикам представлены в табл. 4.1.