После открытия и внедрения в медицинскую практику пенициллина была создана программа систематического поиска но- -вых антибиотиков, результаты которой в настоящее время хорошо известны. Как осуществлялась эта исследовательская программа и как она осуществляется сегодня? В данной главе мы попытаемся дать краткие ответы на эти вопросы.
А.              ОТБОР ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ АНТИБИОТИКОВ
Отбор — это программа, в ходе которой микробные штаммы, являющиеся потенциальными продуцентами антибиотиков, отбирают и выделяют в виде чистых колоний. Опыт показал, что на сегодняшний день большинство микроорганизмов, образующих антибиотики, относится к видам, обитающим в почве. Поэтому в самых разных частях земного шара отбирают пробы почв и выделяют из них различные штаммы микробов. Обычно используют следующую схему: 2—4 г почвы хорошо диспергируют в воде, несколько капель полученной суспензии наносят на питательную агаровую среду и инкубируют, пока не появятся колонии микроорганизмов, присутствующих в данном образце. Затем эти микроорганизмы выделяют и выращивают в чистой культуре.
Выделенные микроорганизмы высевают в колбы со сложной питательной средой и инкубируют не менее 2 или 3 сут после прекращения роста культуры. Это стимулирует синтез и выделение в среду антибиотика у тех штаммов, которые могут его образовывать. Затем проверяют наличие антибиотической активности в культуральной жидкости одним из методов, описанных в гл. 2.
Б. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА АНТИБИОТИКА
Когда установлен микроорганизм-продуцент, необходимо выделить и очистить вещество, ответственное за активность, чтобы все дальнейшие исследования проводить с возможно более чистым образцом. Для этой цели используют все имеющиеся в настоящее время методы химической экстракции природных
веществ. Выбор конкретных методов определяется физико-химическими свойствами данного соединения, в особенности его растворимостью в различных растворителях.
В.              УСТАНОВЛЕНИЕ НОВИЗНЫ АНТИБИОТИКА
Часто поиски новых антибиотиков приводят к тому, что обнаруживают уже известные продукты. Очень важно с самого начала установить, является ли антибиотик новым или он был известен и ранее. Эта проблема часто представляет большую трудность по двум причинам.
1., В научной литературе описано около 3000 различных антибиотиков.

2. Организмы-продуценты, выделенные из почвы, синтезируют антибиотик в очень небольших количествах, и его необходимо отделить от больших количеств других веществ, присутствующих в культуральной жидкости.

Для идентификации антибиотика проводят систематическое сравнение его свойств со свойствами известных антибиотиков. Основные свойства антибиотиков можно классифицировать следующим образом (табл. 7.1).

1. Микробиологические свойства:              спектр              антимикробной

активности, спектр перекрестной устойчивости, некоторые специфические свойства, например влияние на антибиотическую активность условий определения (pH, наличие сыворотки, концентрация и природа ионов, размер инокулума и т. д.); дополнительные данные о природе неизвестного антибиотика можно получить, определив частоту появления устойчивых мутантов, генетическую природу устойчивости (одно- или многоступенчатая) и ее биохимический механизм.

2. Биологические свойства: главные и наиболее легко определяемые параметры — это ЭД50 (раз. II. А) и ЛД50 (разд.

2. Б) для мышей при различных способах введения препарата. Более важным является отношение этих величин, которое не зависит от чистоты используемого препарата, если оба параметра определяются одним компонентом этого препарата.

3. Растворимость в разных растворителях и влияние на нее pH. К этому можно добавить адсорбцию на разных смолах (анионных, катионных), дающую представление о заряде молекулы.
4. Хроматографическое поведение на разных носителях (бумага, тонкий слой) и в разных системах растворителей. На хроматограммах антибиотик можно обнаружить или с помощью реагентов, специфичных к определенным функциональным группам (например, с помощью нингидрина для антибиотиков, содержащих ЫН2-группы, или реактива Толленса для антибиотиков, содержащих восстанавливающие сахара)', или

Микробиологические свойства
Спектр антибактериальной активности Спектр перекрестной устойчивости Некоторые специфические свойства Частота устойчивых мутантов
Биологические свойства
ЭДи прн разных способах введения для разных патогенных микроорганизмов ЛД50 прн разных способах введения для разных животных
Механизм действия
Подавление синтеза макромолекул в растущих бактериях Подавление ферментативных реакций в бесклеточных системах
Растворимость и экстрагируемость
Различные растворители, влияние pH
Различные смолы (анионные, катионные, сильные, слабые)
Хроматографические свойства
Хроматография на бумаге и в тонком слое; различные системы растворителей Электрофорез
Противоточное распределение
Жидкостная хроматография под высоким и низким давлением
Физико-химические свойства Точка плавления
Вращение плоскости поляризации света Элементный анализ Функциональный анализ
Изоэлектрическая точка (электрофокуснрование)
Спектры: ИК, УФ, видимый, ЯМР, масс-спектр Стабильность: pH, свет, специфические ферменты
микробиологически. Последний метод состоит в следующем. Пластинки или бумажные полоски после хроматографирования помещают на агаровую среду с определенными микроорганизмами и инкубируют какое-то время. В результате роста бактерий агар становится мутным всюду, за исключением тех участков около хроматограмм, где присутствует антибиотик, диффундирующий в агар и подавляющий рост бактерий. Помимо хроматографии можно использовать электрофорез, который обычно занимает меньше времени. Хроматографический метод используют не только в аналитических целях, но и для получения небольших количеств очень чистого продукта.

5. Физико-химические свойства: точка плавления, вращение плоскости поляризации света, элементный анализ, анализ главных функциональных групп, ИК- и УФ-спектры, спектр ЯМР и масс-спектр. Другим важным для идентификации показателем является стабильность антибиотической активности после действия разных факторов, таких как свет, pH, специфические ферменты.
   
6. Механизм действия. Даже приблизительное определение механизма действия, во-первых, облегчает идентификацию антибиотика, позволяя сконцентрировать усилия на сравнении с известными препаратами с тем же механизмом действия, а во- вторых, дает некоторую информацию относительно токсичности, присущей исследуемому продукту.

Г. ОРИГИНАЛЬНОСТЬ ПРОГРАММЫ
И ВЕРОЯТНОСТЬ УСПЕШНОГО ЕЕ ЗАВЕРШЕНИЯ
Если не считать некоторых технических новшеств, описанная процедура поиска новых антибиотиков мало чем отличается от той, которая использовалась около 30 лет назад, когда разрабатывались первые такие программы. Однако получить и внедрить в медицинскую практику новые антибиотики стало еще труднее. Во-первых, новый антибиотик может быть допущен к производству только в том случае, если он лучше по своим свойствам, чем уже имеющиеся препараты. Во-вторых, критерии, по которым отбираются новые препараты и которые устанавливаются органами здравоохранения, стали еще более строгими, поэтому многие новые антибиотики не находят применения в клинике, хотя раньше их сочли бы вполне пригодными. В результате вероятность успешного завершения программы становится все меньше и меньше. Поэтому исследователи направляют свои усилия на поиск технических или принципиальных новшеств, которые существенно улучшили бы программу. Предложения, выдвигаемые различными экспертами, связаны с тремя категориями факторов: 1) количественными,

2. качественными и 3) организационными.

1. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ФАКТОРЫ

Количественные факторы действуют строго пропорционально. При прочих равных условиях, чем больше исследовано культуральных жидкостей, тем больше вероятность обнаружения полезного продукта. Ограничивающим обстоятельством здесь является стоимость исследований. Однако количество выделенных и исследованных штаммов можно значительно увеличить, если использовать автоматизированные методы и микроопределения (гл. 2).

2. КАЧЕСТВЕННЫЕ ФАКТОРЫ

Эти факторы можно подразделить на три категории: 1) поиск новых организмов-продуцентов, 2) изменение условий культивирования и 3) использование новых методов отбора.
% Поиск новых организмов-продуцентов
Широко распространено мнение, что если продолжать выделять и испытывать те же микроорганизмы, что и последние 130- лет, то вероятность открытия новых антибиотиков будет ,-очень мала. Это мнение основано на неутешительном опыте повторного обнаружения уже известных антибиотиков — к несчастью, довольно распространенном. К настоящему времени "выделено по крайней мере 7 000000 организмов-продуцентов, описано и частично охарактеризовано более 3000 различных антибиотиков и около 100 новых антибиотиков описывается каждый год. Однако многие специалисты считают, что не все типы антибиотиков, существующие в природе, уже открыты, и что шансы обнаружить новые химические соединения значительно возрастут, если мы будем исследовать необычные, редкие микроорганизмы. Это мнение основано на результатах практических наблюдений и на представлении о том, что структура вторичных метаболитов микроорганизмов является выражением генетических свойств соответствующих видов продуцентов.
В связи с этим возникают две проблемы: одна теоретическая, а другая практическая. Теоретическую проблему можно сформулировать следующим образом: как далеки друг от друга должны быть две группы микроорганизмов по таксономической или, точнее, по эволюционной шкале, чтобы их вторичные метаболиты достаточно сильно отличались друг от друга. Известно, что вторичные метаболиты, в том числе и метаболиты с антибиотической активностью, совершенно различны у бацилл, актиномицетов и мицелиальных грибов (три большие группы продуцентов антибиотиков). Представители этих групп широко использовались при поиске новых антибиотиков, поэтому необходимо внутри них выделить подгруппы (роды), которые исследовались не столь детально. Отсюда вытекает практическая проблема: редкие роды микроорганизмов не были исследованы потому, что их представителей трудно выделить и вырастить.
Описаны многие методы и программы отбора, которые, вероятно, должны способствовать выделению из почвы представителей редких родов, в особенности родов, относящихся к актиномицетам.
б.              Изменение условий культивирования
Первым этапом в каждой программе отбора является выделение микроорганизмов из почвы с последующим выращиванием тестируемых колоний обычно в жидкой среде. Предположим, что выделенные микроорганизмы принадлежат к редкому роду, который, вероятно, отличается генетически от обычных
родов. Известно, что вторичные метаболиты не являются незаменимыми веществами и у микроорганизма нет необходимости синтезировать их только потому, что он обладает нужной для этого генетической информацией. Многие вторичные метаболиты синтезируются уже после прекращения роста клеток, т. е. в идиофазе. Часто их синтез контролируется такими механизмами, как репрессия конечным продуктом, С-катаболитная репрессия, N-репрессия, РС^-репрессия. Поэтому недостаточно найти микроорганизм с новым геномом: необходимо вырастить его в условиях, при которых происходит максимальная экспрессия генома.
Вообще говоря, эти условия отличаются от тех, которые обеспечивают быстрый рост. Поэтому необходимо инкубировать культуру в течение какого-то времени после прекращения роста, причем так, чтобы в идиофазе уровень источников углерода и азота и концентрация РО4 были не слишком высокими.
в.              Использование новых методов отбора
При прочих равных условиях вероятность обнаружения нового антибиотика зависит от используемого теста в том смысле, что эта вероятность выше, если данный тест позволяет обнаружить активности, не выявляемые обычными методами.
Рассмотрим в качестве примеров хорошо известные факты. При выращивании на синтетических средах обнаруживаются антиметаболиты, которые часто оказываются неактивными, если используются сложные среды. Отбор зависит от pH среды. Преимущественно отбираются вещества с изоэлектрической точкой* близкой значению pH среды, поскольку антибиотики часто обладают максимальной активностью именно в изоэлектрической точке.

3. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ

Эти факторы определяют, как должна быть организована исследовательская программа. Любой перспективный антибиотик должен обладать по крайней мере следующими свойствами: должен быть 1) новым и патентоспособным препаратом и

2. активным в отношении экспериментальных инфекций животных, но 3) не должен оказывать серьезного токсического действия в дозах, используемых в химиотерапии.

Хотя описанные выше программы направлены на увеличение вероятности обнаружения новых активных продуктов, они, конечно, не гарантируют, что любой обнаруженный активный препарат будет новым. Точно так же никоим образом они не могут гарантировать, что продукты, активные in vitro в отношении бактерий, окажутся эффективными при лечении экспе
риментальных инфекций или что они будут нетоксичными. Наличие описанных выше трех основных свойств должно быть проверено для любого предполагаемого нового препарата.
Мы можем представить проблему в том виде, как она boss' никает на этом этапе, задав другие вопросы. Нужно ли cнaчa- i ла определять эффективность и нетоксичность продукта, а по- ? том его новизну или это лучше делать в обратном порядке? Точно так же, поскольку свойства, характеризующие данный антибиотик и отличающие его от всех других препаратов, весьма многочисленны и их изучают с помощью различных методов, дающих информацию разного типа, что нужно исследовать сначала, а что потом? Эти два вопроса иллюстрируют тот факт, что программа первичного отбора должна быть составлена из набора подпрограмм, использующих разные методы и направленных на получение информации относительно одного или нескольких из трех необходимых свойств препарата (новизны, эффективности, отсутствия токсичности). Важно решить вопросы организации этих программ таким образом, чтобы они были наиболее эффективными, т. е. давали нужную информацию при наименьших усилиях и наименьшей стоимости.
Программы отбора, используемые в различных исследовательских лабораториях, различаются по последовательности этапов; это связано в первую очередь с различиями в научных интересах сотрудников, с их квалификацией и опытом работы данной исследовательской группы в прошлом. Тем не менее можно сделать некоторые заключения общего характера: 1) определить, является ли данный препарат новым или он был известен и ранее, бывает обычно сложнее, чем оценить его эффективность или токсичность; 2) разные свойства антибиотика имеют разное значение для его идентификации; кроме того, некоторые из этих свойств можно определить с использованием не очень чистых препаратов, а для определения других необходимы препараты высокой степени чистоты.
Стоимость теста прямо связана с количеством, и — в еще большей степени — со степенью чистоты анализируемого образца. Идеальной можно было бы считать такую программу отбора, при которой одновременно определялись бы свойства продукта и осуществлялась его идентификация с использованием небольших количеств неочищенного препарата.
Д. ПОЛУЧЕНИЕ АНАЛОГОВ ИЗВЕСТНЫХ ПРОДУКТОВ
Программа отбора, о которой мы говорили до сих пор, направлена на обнаружение новых соединений, обладающих антибиотической активностью. Но такая программа может иметь своей целью и выделение соединений, сходных с известными антибиотиками, но отличающихся от них небольшими модификациями структуры, которые могут улучшить их свойства.
Для получения аналогов известных антибиотиков используют три подхода: 1) синтез, 2) получение мутантов, 3) биосинтез.

1. СИНТЕЗ

Этот подход состоит в химической модификации известных антибиотиков. Его основные положения и цели описаны в гл. 5.

2. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ

Как отмечалось в гл. 6, антибиотики, как и другие вторичные метаболиты, часто образуются в виде семейств близкородственных соединений. Индуцирование мутаций у штамма дикого типа может благоприятствовать биосинтезу продуктов, образуемых исходным штаммом в следовых количествах или не образуемых вообще.

3. БИОСИНТЕЗ

Некоторые штаммы-продуценты способны включать в молекулу антибиотика предшественники, сходные с «природными» предшественниками, синтезированными самим штаммом. Примером такого рода является биосинтез пенициллина V после добавления фенилацетата к культуральной жидкости штамма, образующего пенициллин G. Соединение мутационного и биосинтетического подходов называют мутационным биосинтезом или мутасинтезом. Он состоит в генетическом превращении штамма-продуцента в мутант, называемый идиотрофом; этот мутант не может синтезировать антибиотик, если в культуральную среду не добавлено вещество, соответствующее какой-то составной части молекулы этого антибиотика. Добавляя к среде аналоги составной части, с помощью такого штамма можно получить другие антибиотики. Этот подход в течение нескольких лет используют для поисков новых аминогликозидных антибиотиков.