Выделение арахидоновой кислоты с высокой степенью чистоты (90—95%) описано Ault, Brown (1934), которые применили методику бромироьания — дебромирования с последующей очисткой путем кристаллизации и вакуумной разгонки. Последнюю для получения очищенной кислоты использовали также Shinowara, Moury et al. (1972). Предпринимались попытки изолировать очищенную кислоту, используя различную растворимость ее литиевых солей в ацетоне, однако бромирование-деб- ромирование ещэ долгое время было основным способом получения арахидоновой кислоты. Основные способы выделения арахидоновой кислоты, характерные для 30-х и 40-х годов, приведены в обзоре Ralstone (1948).
Herb et al. (1951) описали способ получения природной арахидоновой кислоты в виде метилового эфира, который стал основой ее последующего выделения.
Суть примененного нами способа заключается в следующем. Измельченные надпочечники экстрагируют несколько раз этиловым спиртом при комнатной температуре, после чего тщательно экстрагируют те же ткани эфиром, освобожденным от перекиси. Спиртовые экстракты объединяют и упаривают в вакууме, водную эмульсию жирных кислот быстро экстрагируют эфиром. Все эфирные экстракты объединяют, удаляют растворитель в вакууме и получают продукт, содержащий 8—9% арахидоновой кислоты (спектрофотометрическое определение). Полученный липидный экстракт омыляют спиртовым раствором КОН в токе азота и после отделения неомыляемой части липидов подвергают низкотемпературной кристаллизации в ацетоне при 0°, —18° и —40°С, отделяя каждый раз осадок. Фильтрат митилируют безводным метанолом в концентрированной НС1 и полуг ют продукт, содержащий 25% арахидоновой кислоты, который затем подвергают очистке на колонке с кремниевой кислотой и вакуумной разгонке при остаточном давлении 0,015 мм рт. ст. Чистота получаемого таким способом метилового эфира арахидоновой кислоты — 95%.
Количественное выделение арахидоновой и других полине- насыщенных высших жирных кислот (эйкозатриеновой, эйкоза- пентаеновой, эйкозагексаеновой и др.) в виде метиловых эфи-
ров из свиной печени детально описано Privett et al. (1963). Авторы разработали условия, обеспечивающие максимальный выход кислот, практически не содержащих примесей. Количественное разделение метиловых эфиров высших жирных кислот методом адсорбционной хроматографии на силикагеле, импрег- нированном нитратом серебра, описано De Vries (1963).
В 1972 г. Light и Samuelsson опубликовали данные о выделении арахидоновой кислоты из необычного источника: коралла Plexaura homomalla (Esper) из Карибского региона, содержащего дериват 15-ЭПИ-ЛГА2 и его метиловый эфир (Light, 1972). Для выделения кислоты авторы экстрагировали измельченный коралл хлороформ-метанольной смесью и транс-этерифициро- вали полученный продукт метоксидом натрия. Метиловые эфиры ненасыщенных жирных кислот очищали хроматографически на силикагеле, используя в качестве элюента 5%-ный раствор диэтилового эфира в гексане. Метиловые эфиры кислот анализировали методом газожидкостной хроматографии. Было найдено, что содержание арахидоновой кислоты в липидах коралла составляет 33,9% (или 0,4% от сухого вещества коралла), содержание С26:0   12%, С28:0   2,4%.
Одним из возможных источников арахидоновой кислоты в нашей стране являются отходы производства инсулина и адреналина. Тем не менее методы использования данного продукта для получения из него арахидоновой кислоты ранее не были описаны.
Для выделения арахидоновой кислоты из отходов эндокринного производства нами была разработана многократно апробированная методика (Н. В. Серебрянников с соавт., 1976).
Липиды, взятые тотчас же после технологического процесса, стабилизируют добавлением метабисульфита натрия (0,7—0,9 г на литр) и барботированием сквозь массу липидов азота особо чистого (300 мл/мин на литр) в течение 15 мин. Емкостью для обработки липидов служили баллоны оранжевого стекла или фторопластовая светонепроницаемая тара. Обработанные таким образом липиды сохраняют при температуре не выше 10°С. Получение ненасыщенных высших жирных кислот осуществляют в стеклянном реакторе емкостью 5 л, снабженном пятью патрубками для подключения к системе обеспечения. В реактор помещают 1198 г стабилизированных липидов при постоянном барботировании инертного газа и 1500 мл изопропилового спирта; полученную смесь перемешивают 15 мин. Далее в реактор прибавляют по каплям в течение 40 мин 1425 мл 44%-ного водного раствора едкого калия; процесс омыления проводят при 38—40°С при непрерывном барботировании азота и работающей мешалки в течение 4—4,5 ч (полнота омыления контролируется с помощью тонкослойной хроматографии; в качестве подвижной фазы используется бензол).
Затем работу реактора прекращают и его содержимое бы-
стро переносят в делительные воронки на 1—2 л, предварительно разбавив половинным количеством дистиллированной воды, после чего экстрагируют 300—400 мл диэтилового эфира, насыщенного водой и инертным газом. Операцию экстрагирования повторяют 3—4 раза. Водный отстоявшийся слой сливают в реактор и подкисляют 5 н. раствором H2S04 до pH 3,0. Подкисление продолжают в течение 1,5—2 ч при непрерывном поступлении H2SO4 каплями, постоянном охлаждении реактора, барботировании азота и работающей мешалки. После завершения процесса подкисления освобождаются от образовавшегося осадка посредством фильтрации в вакууме. Полученный фильтрат разливают в делительные воронки, добавляя в них половинное количество эфира, насыщенного инертным газом, тщательно взбалтывают и оставляют до полного разделения. Операцию повтопяют 4—5 раз.
Все эфирные вытяжки объединяют, упаривают до 1/2 объема, отмывают водой, насыщенной хлоридом натрия, эфиром и инертным газом, до нейтральной реакции и затем обезвоживают прокаленным сульфатом натрия.
В стеклянном реакторе к нагретому до 60—65°С насыщенному раствору мочевины в пропиловом спирте и этаноле при перемешивании с целью клатратообразования прибавляют жирные кислоты, освобожденные от эфира, и выдерживают 12 ч при 20—22°С. Выпавший осадок комплекса насыщенных кислот с мочевиной отфильтровывают, промывают осадок насыщенным раствором мочевины в метиловом спирте, а фильтрат при постоянном перемешивании, барботировании азота охлаждают ДО ( 3) — (—5°С) и выдерживают 2 ч при этих же условиях. Выпавший осадок комплекса диеновых жирных кислот с мочевиной отфильтровывают, промывают насыщенным раствором мочевины в метиловом спирте, а в фильтрат, содержащий ненасыщенные жирные кислоты, прибавляют половинное количество дистиллированной воды, насыщенной эфиром и инертным газом, с несколькими каплями НС1. После взбалтывания водный раствор, содержащий мочевину, отделяют, повторяя операцию 4—5 раз.
Ненасыщенные жирные кислоты извлекают из раствора после^ полного удаления мочевины эфиром с последующей от- гонкоп растворителя под вакуумом. Полученные ненасыщенные жирные кислоты взвешивают, разводят 10-кратным количеством ацетона и последовательно фракционируют при температурах 20 ,              40°, —70°С. Кристаллизацию каждый раз продол
жают в течение 3—4 ч. После кристаллизации при —70°С собирают надосадочную жидкость, обезвоживают сульфатом натрия, отгоняют в вакууме ацетон, полученный продукт подвергают вакуумной разгонке с последующей хроматографической очисткой и идентифицируют с помощью тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии.
Хроматографическое определение арахидоновой кислоты проводят в тонком слое силикагеля G (Merk), используя в качестве подвижных фаз следующие системы растворителей: (1) гексан—эфир-—ледяная уксусная кислота (70:30:2), Rf 0,56; (II) хлороформ—метанол—уксусная кислота—вода (90:6:1:0,75), Rf 0,43. Для идентификации арахидоновой кислоты хроматографические пластинки опрыскивают 10%-ной фосфорно-молибденовой кислотой. Спектрофотометрическое определение арахидоновой кислоты осуществляют после щелочной изомеризации. После метилирования арахидоновую кислоту определяют методом ГЖХ (В. Г. Гандель с соавт., 1976): анализ проводят с помощью стеклянной колонки длиной 2 м и внутренним диаметром 2 мм с неподвижной фазой 5% SE-30 на «Хромосорб WAW». Температура хроматографирования 200°С, температура инжектора 260°С. Г аз-носитель — гелий, давление на выходе — 0,4 атм. В качестве внутреннего стандарта использовали метиловый эфир линоленовой кислоты.
Масс-спектрометрию метилового эфира арахидоновой кислоты проводили на масс-спектрометре JMS-0,l-Sg-2 при следующих условиях: стеклянная колонка длиной I м с внутренним диаметром 2 мм, жидкая фаза 3% OV-1 на носителе Gas Chrom Q (80—120 мл). Температура инжектора 270°С, температура колонки 215°С, газ-носитель — гелий, скорость газа носителя 60 мл1мин, температура сепаратора 220°С. Ионизирующее напряжение 22,5 эВ, температура источника ионов 220°С. На самописце полного ионного тока отмечен один ярко выраженный пик. Полученный масс-спектр имеет все характерные ионы, соответствующие метиловому эфиру арахидоновой кислоты.
С препаративными целями применяли также хроматографическую очистку арахидоновой кислоты по следующей методике. На 50 хроматографических пластинках размером 10Х Х20 см с тонким слоем силикагеля G (Merk) наносят 5,45— 5,50 г концентрата арахидоновой кислоты (с содержанием не менее 60%) в 10 мл этилового спирта и хроматографируют восходящим способом, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей: хлороформ—метанол—'уксусная кислота—вода в соотношении 90:6:1:0,75 в среде азота. После окончания хроматографирования полосу с Rf 0,66—0,68 отделяют и элюируют этиловым спиртом. Элюат испаряют в глубоком вакууме до полного удаления растворителя и получают 1,45— 1,55 г арахидоновой кислоты чистотой 92—97% (йодное число 319—321, кислотное число 65—70, перекисное число не более 0,01).
Для получения арахидоновой.кислоты, пригодной для включения в биосинтез ПГ, с успехом может быть использован медицинский арахиден.
Арахиден представляет собой смесь этиловых эфиров цис-
форм арахидоновой, линолевой, ли- ноленсшой, олеиновой, эйкоза- и до- козапентаеновых и докозагексаено- вых кислот (табл. 27). Он был применен нами как источник арахидоновой кислоты для биосинтеза ПГ.
Наряду с липидами надпочечников и поджелудочной железы крупного рогатого скота, используемых в производстве эндокринных препаратов, перспективным источником полиненасыщенных высших жирных кислот являются липиды гидробион- тов, значительно более богатые указанными соединениями по сравнению с наземными животными. Так, суммарные липиды трески Gadus morhua содержат до 4,7% арахидоновой кислоты, до 16,6% эйкозапентаеновой и до 32,9% эйкозагексаеновой кислот (Jangaard et al., 1967).
С целью расширения сырьевой базы получения предшественников ПГ и сокращения технологического цикла выделения нами был использован жир пресноводной эндемичной рыбы озера Байкал голомянки большой, содержащей до 47% жира (Н. В. Серебрянников с соавт., 1976). Жир голомянки представляет собой жидкий прозрачный продукт желтоватого цвета с легким специфическим запахом рыбьего жира, содержащий стерины, фосфатиды, диглицериды, триглицериды и эфиры жирных кислот, в том числе полиенового ряда. Жир выделяют из рыб путем прессования, вытапливания при низкой температуре. Экстракцию проводят органическими растворителями, например этиловым эфиром, хлороформом, смесью хлороформ-метанол (2:1). Эффективной является быстая экстракция измельченной в замораженном состоянии рыбы холодным этиловым эфиром при температуре 0—4°С с последующим обезвоживанием и отгонкой экстрагента в вакууме.
К 150 г жира голомянки добавляют 875 г 40%-ного раствора едкого кали в метаноле и перемешивают при комнатной температуре в течение 2—3 ч в токе аргона. Метанол отгоняют в вакууме в токе аргона до 1/3 первоначального объема. К остатку в токе аргона добавляют двойной объем дистиллированной воды и экстрагируют эфиром, насыщенным дистиллированной водой и аргоном, порциями до полного истощения неомыляемой части жира. Остаток после экстрагирования подкисляют 5 н. H0SO4 под слоем эфира в токе аргона при охлаждении до PH 3,0, трижды экстрагируют равными объемами эфира, насыщенного аргоном. Объединенные эфирные вытяжки промывают водой, насыщенной эфиром и аргоном, до нейтральной реакции и сушат безводным сульфатом натрия. Сульфат натрия отде-
ляют, эфир отгоняют в вакууме в токе аргона и получают концентрат-1 ненасыщенных высших жирных кислот. Числовые показатели: вес 125 г, кислотное число 3,45, йодное число 145, перекисное число 0,015; содержание 5, 8, 11, 14-эйкозатетраено- вой кислоты около 2,6 г, содержание 5, 8, 11, 14, 17-эйкозапен- таеновой кислоты около 1 г.
К концентрату-1 ненасыщенных высших жирных кислот добавляют 525 г мочевины, 1,25 л метанола, смесь нагревают до 45°С, затем охлаждают до 4°С и выдерживают при этой температуре 6 ч. Фильтрат, содержащий ненасыщенные полиено- вые кислоты, освобожденный от мочевинного комплекса насыщенных и моноеновых жирных кислот, упаривают в вакууме, полученный продукт пол неновых кислот подвергают низкотемпературному фракционированию и хроматографической очистке. Все операции выполяются в токе аргона. В результате получают концентрат ненасыщенных высших жирных кислот со следующими числовыми показателями: вес около 20 г, кислотное число 3,0, перекисное число 0,609, йодное число 175, содержание 5, 8, 11, 14-эйкозатетраеновой кислоты 1,6 г, содержание 5, 8, 11, 14, 17-эйкозапентаеновой кислоты 0,6 г.
Для стабилизации арахидоновая кислота может быть переведена в метиловый эфир, который перед биосинтезом ПГ гидролизуют. Добавляют к кислоте антиоксидант-токоферол в количестве 0,01—0,5%, в низких концентрациях не влияющий отрицательно на биосинтез.
При сохранении в герметически запаянных ампулах темного стекла в среде азота при —20°С арахидоновая кислота пригодна для включения в биосинтез в течение 6 мес.