ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ПГ ГРУПП Е И F ИЗ ЖИВОТНЫХ ОБЪЕКТОВ
Несколько килограммов (5—10) измельченного с помощью неметаллического гомогенизатора животного материала, взятого из только что забитого скота или материала, сохраняющегося после забоя при температуре не выше —20°С, смешивают с равным по весу количеством 0,2 М фосфатного буфера pH 8,0 (можно применять также следующие буферные растворы: 0,2 М аммиачный буфер, pH 7,5-8,5; 0,05 трис-буфер, pH 7,5-8,5), оттаивают смесь (если материал был заморожен) при комнатной температуре, тщательнр перемешивают в стеклянном или фарфоровом сосуде и дважды экстрагируют половинным от объема смеси количеством эфира классификации «для наркоза», предварительно дезаэрированного инертным газом особой чистоты. Эфирные вытяжки объединяют, эфир отгоняют с помощью роторного испарителя в глубоком вакууме при температуре не выше 20°С, остаток досушивают в вакууме до полного удаления влаги и получают порошкообразную массу (про- дукт-1).
К оставшемуся после отделения эфира исходному биологическому материалу добавляют 5% 5 н. НС1, тщательно перемешивают и трижды экстрагируют равным объемом эфира. Эфирные вытяжки объединяют, промывают насыщенной эфиром и инертным газом дистиллированной водой до полного удаления хлор-иона (pH после промывания не ниже 5,5), эфир отгоняют в глубоком вакууме при температуре не выше 20°С. Остаток
досушивают в вакууме до полного удаления влаги и получают продукт-П.
Около 5 мг продукта-1 растворяют в 10 мл эфира и подвергают хроматографированию с использованием в качестве подвижной фазы: (I) бензол—диок- сан—уксусная кислота (20:20:1); (П) эта л ацетат—уксусная кислота изооктан — метанол — вода (110:30:10:35:100); (III) этилаце- тат—уксусная кислота'—изооктан—вода (110:20:50:100); (IV) хлороформ—'метанол—уксусная кислота—вода (90:6:1:0,75)
(табл. 24). Системы II и III предварительно помещают в делительные воронки, встряхивают и оставляют в покое в течение 2 ч, после чего отделяют от водного слоя.
При наличии пятен в зонах, характеризующихся вышеуказанными значениями Rf, продукт растворяют в этаноле, фильтруют через стеклянный фильтр № 5, отгоняют спирт в глубоком вакууме при температуре не выше 25°С, остаток досушивают в вакууме до полного удаления влаги и присоединяют к продукту-11.
Смесь помещают в пенициллиновые склянки в токе азота, герметически укупоривают и хранят при температуре не выше 5°С. 5 г полученной смеси растворяют в 200 мл эфира и подвергают 5-стадийному противоточному распределению с применением 0,2 М фосфатного буфера с pH 6,5. Буферные фазы, не объединяя, подкисляют 5 н. НС1 до pH 3,5 и каждую из них экстрагируют равными объемами эфира трижды. Эфирные вытяжки, также как и эфирную фазу, после 5-кратного распределения подвергают хроматографической очистке в тонких слоях сорбента, используя одщ из указанных систем. Зоны с соответствующими значениями Rf элюируют этиловым спиртом и идентифицируют ПГ группы Е спектрофотометрически после добавления щелочи; группы F — биологическим методом, а также по температуре плавления.
ПГ tnn.0°C
Е, 115,-117
Е2 68—69
Fi„ 102—103
К оставшемуся после отделения эфира исходному биологическому материалу добавляют 5% 5 н. НС1, тщательно перемешивают и трижды экстрагируют равным объемом эфира. Эфирные вытяжки объединяют, промывают насыщенной эфиром и инертным газом дистиллированной водой до полного удаления хлор-иона (pH после промывания не ниже 5,5), эфир отгоняют в глубоком вакууме при температуре не выше 20°С. Остаток
досушивают в вакууме до полного удаления влаги и получают продукт-П.
Около 5 мг продукта-1 растворяют в 10 мл эфира и подвергают хроматографированию с использованием в качестве подвижной фазы: (I) бензол—диок- сан—уксусная кислота (20:20:1); (П) эта л ацетат—уксусная кислота изооктан — метанол — вода (110:30:10:35:100); (III) этилаце- тат—уксусная кислота'—изооктан—вода (110:20:50:100); (IV) хлороформ—'метанол—уксусная кислота—вода (90:6:1:0,75)
(табл. 24). Системы II и III предварительно помещают в делительные воронки, встряхивают и оставляют в покое в течение 2 ч, после чего отделяют от водного слоя.
При наличии пятен в зонах, характеризующихся вышеуказанными значениями Rf, продукт растворяют в этаноле, фильтруют через стеклянный фильтр № 5, отгоняют спирт в глубоком вакууме при температуре не выше 25°С, остаток досушивают в вакууме до полного удаления влаги и присоединяют к продукту-11.
Смесь помещают в пенициллиновые склянки в токе азота, герметически укупоривают и хранят при температуре не выше 5°С. 5 г полученной смеси растворяют в 200 мл эфира и подвергают 5-стадийному противоточному распределению с применением 0,2 М фосфатного буфера с pH 6,5. Буферные фазы, не объединяя, подкисляют 5 н. НС1 до pH 3,5 и каждую из них экстрагируют равными объемами эфира трижды. Эфирные вытяжки, также как и эфирную фазу, после 5-кратного распределения подвергают хроматографической очистке в тонких слоях сорбента, используя одщ из указанных систем. Зоны с соответствующими значениями Rf элюируют этиловым спиртом и идентифицируют ПГ группы Е спектрофотометрически после добавления щелочи; группы F — биологическим методом, а также по температуре плавления.
ПГ tnn.0°C
Е, 115,-117
Е2 68—69
Fi„ 102—103