Каждый из лабораторных методов имеет свои достоинства и недостатки, различную диагностическую ценность. Их чувствительность и специфичность существенно зависят от типа выявляемого возбудителя, качества лабораторного оборудования и реактивов, поэтому результаты обследования, проведенного в разных клинических и исследовательских лабораториях, могут быть различны.
1. Культуральный метод диагностики бактериальных и ряда вирусных инфекций (в том числе краснухи и герпеса) - изоляция возбудителя на культуре клеток с последующей окраской с помощью специфических антител. Метод высокоспецифичен, но длительный, трудоемкий, требует соответствующих условий работы с клеточными культурами и
38
дорогостоящий процесс. Для практического здравоохранения метод полезен в качестве подтверждающего, но его невозможно использовать для практической диагностики. Разработана модификация метода «shellvial», которая получила название «быстрый культуральный метод» (БКМ). Метод заключается в сокультивировании исследуемых образцов и клеток культуры ткани с последующим выявлением вирусных белков в зараженных клетках в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) с помощью поли- и моноклональных антител. БКМ с последующей идентификацией вирусных антигенов с помощью РИФ - высокоинформативный метод, позволяющий получить развернутый ответ при наличии культуры клеток через 3-4 суток и выявить инфекционно активный вирус. БКМ обладает как высокой чувствительностью и специфичностью, так и высокой прогностической значимостью. БКМ позволяет выявлять ВПГ и ЦМВ в материалах из различных органов и тканей как при отсутствии симптомов ГВИ, так и в острой фазе заболевания, дает возможность обнаруживать ГВ также в аутопсийном материале. БКМ позволяет диагностировать ВПГ- и ЦМВ- инфекции уже на ранних стадиях заболевания, а именно в тот период, когда еще не выявляются специфические антитела. Одним из преимуществ количественного определения инфекционной активности ГВ с помощью БКМ является возможность мониторинга вирусной нагрузки при интерферонотерапии, а также при терапии другими противовирусными препаратами.
2. РИФ можно использовать при выявлении инфекционных агентов in situ при жизни и посмертно (2-3 суток). Однако следует учитывать, что при использовании поликлональных антител могут иметь место неспецифические реакции и определенный процент гипердиагностики. Моноклональные антитела к раннему и сверхраннему белкам ЦМВ обладают большей специфичностью, по сравнению с поликлональными антителами, но в ряде случаев могут быть ложноотрицательные результаты. Достаточно эффективным и менее дорогим методом диагностики врожденной инфекции является исследование клеток осадка мочи новорожденных в РИФ с использованием типоспецифических сывороток, содержащих антитела к широкому набору антигенов. Этот метод позволяет получить развернутый ответ через 2-3 суток с момента получения материала. Однако следует иметь в виду, что при диагностике инфекций в РИФ с помощью ПКА могут иметь место неспецифические реакции и определенный процент гипердиагностики.
3. Иммунохроматографические (ИХМ) и ферментспецифические методы применяются для экспресс-диагностики, основаны на образовании комплекса антиген-антитело-цветной латекс, который формирует окрашенную зону на нитроцеллюзном фильтре. Оценка теста происходит по характерному окрашиванию в лунке плашки; чувствительность метода 87,5%.
4. Для верификации урогенитальной хламидийной инфекции используется такой метод диагностики, как реакция специфического лейкоцитолиза, основанная на определении в крови высокого показателя разрушения лейкоцитов у больных. Реакция обладает высокой чувствительность 100% и может быть использована в качестве подтверждающего теста в комплексной диагностике урогенитальных заболеваний.
5. Экспересс-диагностика вирусных инфекций на основе модифицированной реакции связывания комплемента (м-РСК) - позволяет: выявлять как антигены возбудителей и антитела к ним различных классов, так и ранние специфические иммунные комплексы; проводить определение этапов инфекционного процесса при ВУИ.
Установлено, что у ребенка или у матери «свободные антитела» при повторных обострениях инфекционного процесса относятся к подклассу IgG3, заменяясь антителами подкласса IgG1-2 и далее IgG4 при купировании основного заболевания. Подобная схема замещения антител в различных подклассах IgG позволяет при обследовании новорожденного и его матери ретроспективно дифференцировать разницу в превалировании антител в определенных подклассах IgG и по ней рассчитать примерное время инфицирования возбудителем плода. Чем далее подкласс IgG матери отстоит по указанной схеме от подкласса IgG антител ребенка, тем раньше во время беременности было внутриутробное инфицирование плода. Определение подклассов антител позволяет установить: преимущественный синтез
антител IgM класса при первично-острой инфекции, IgG3 - при обострении процесса, а антител IgG4 подкласса - при хроническом течении заболевания. Выявленное распределение антител по подклассам у новорожденных детей с внутриутробной герпетической инфекцией и их матерей позволяет ретроспективно установливать время инфицирования плода. Смена антител по типу IgM - IgG3 - IgG1-2 - IgG4 характерна для различных вирусных инфекций.
Для этапной характеристики инфекционного процесса у детей раннего возраста рекомендуется одновременное проведение лабораторного исследования крови ребенка и матери на наличие специфических антител на самых ранних сроках заболевания с применением метода м-РСК.
6. Наиболее доступным для практического применения и высокочувствительным в настоящее время является метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с помощью моноклональных антител. Чувствительность данного теста достигает 96-98% и зависит от концентрации возбудителя в исследуемом материале. Ложноотрицательные ответы могут быть связаны с малым числом возбудителя в пробе, ложноположительные - с неспецифической адсорбцией красителя на обрывках ткани и лейкоцитах.
Г лавным достоинством ПИФ является возможность проведения прямой индикации хламидий, визуально контролируемой в люминесцентном микроскопе, в пораженных клетках больного УГХ. Это позволяет до сих пор считать ее золотым стандартом, несмотря на меньшую чувствительность и специфичность по сравнению с культуральным методом.
7. Молекулярно-билогические методы значительно расширили, а в ряде случаев изменили наши представления об этиопатогенезе инфекционных заболеваний, в том числе и ВУИ. Методы иммуногенодиагностики основаны на выявлении ДНК и РНК изучаемого объекта посредством амплификации и/или гибридизации целевых полинуклеотидных последовательностей.
Правила использования лабораторных методов для диагностики инфекционного заболевания, в том числе ВУИ
1) Выбор объекта исследования
От правильного выбора объекта исследования зависит и его результат, вся последующая тактика ведения больного.
- Традиционный подход к крови как к универсальному объекту для исследования в настоящее время является малоперспективным, так как концентрация в кровотоке многих микроорганизмов нередко значительно более низкая, чем во входном очаге инфекции, что, естественно, превышает предел чувствительности аналитического метода. Следует отметить, что в крови возбудители выявляются, как правило, при генерализованных формах инфекции или синдроме выраженной иммуносупрессии.
- При нейроинфекциях для исследования целесообразно использовать спинно-мозговую жидкость.
- Хотя установлено, что хламидии персистируют в моноцитах крови, определение их ДНК в этих клетках не является приемлемым маркером острого респираторного хламидиоза. В то же время исследование жидкости бронхо-альвеолярного лаважа оказывается весьма информативно. В ряде случаев при урогенитальной патологии хламидии могут персистировать в маточных трубах, в спайках, но при этом в соскобах из нижних отделов урогенитального тракта они не обнаруживаются. По некоторым данным частота выявления СМЛгасЬошаи8 методом ПЦР у женщин составляет 22,5% при исследовании материала из цервикального канала, 29% - из влагалища и 14% - из уретры, поэтому для диагностики урогенитальных инфекций желательно брать материал из нескольких точек.
- Чувствительность при исследовании вагинальных проб на разные возбудители методом ПЦР может быть низкой (53-73%), рекомендовано исследование смеси соскобов слизистых уретры, влагалища и цервикального канала у женщин.
- Применяя ПЦР, целесообразно исследовать несколько биологических сред (кровь, моча, ликвор, трахеобронхиальный аспират), а также использовать методики с количественным определением числа копий (антигенная нагрузка) в режиме «реального времени». Материалом для ПЦР при этом может служить любая биологическая среда организма: от новорожденных - пуповинная кровь, слюна, моча, спинномозговая жидкость, кровь, смывы трахеи, рото- и носоглотки, мазки с конъюнктивы, из уретры и т. д.; от матерей - моча, кровь, цервикальный и вагинальный секреты; околоплодные воды; гистологические препараты. Однако в тех случаях, когда этиология заболевания связана с вирусными агентами, критерием активного периода ВУИ считается обнаружение возбудителя в крови или ликворе (если имеет место поражение ЦНС). Для выявления ЦМВ методом ПЦР материалом для исследований являются кровь, слюна, моча, ликвор.
- На основании результатов современных исследований рекомендовано использование смесей субстратов, которые увеличивают вероятность выявления инфекционных агентов. Оптимально одновременное выявление
U.urealyticum, M.hominis, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex 1,2 в смеси слюны, мочи, слезного отделяемого (смыва с конъюнктивы) у детей.
Большое значение имеет то, как был взят образец. Неправильная техника забора может привести к тому, что инфицированные клетки не попадут в исследуемую пробу, либо избыточное количество посторонних примесей (гной, кровь и др.) будет затруднять дальнейшее исследование. Неправильная транспортировка и хранение образца, повторные замораживания и размораживания также негативно влияют на результат анализа.
2) Выбор метода и сроков исследования
При серологических исследованиях, следует помнить о том, что многие внутриклеточные микроорганизмы являются слабыми иммуногенами, то есть антительный ответ на них развивается недостаточно. Поэтому, при персистирующих, латентных инфекциях, когда возбудитель не размножается и не выходит из клеток, антител может не быть. Как правило, серологические методы целесообразно использовать при наличии распространенных воспалительных процессов, когда массивная антигенная нагрузка приводит к выработке достаточного количества антител (исследование парных сывороток матери и плода).
Молекулярно-генетические методы пригодны как для диагностики манифестных форм инфекции, так и для латентных, субклинических форм, когда отмечается длительная персистенция возбудителя. При этом следует помнить, что обнаружение генетического материала возбудителя служит лишь свидетельством инфицирования, но не наличия инфекционного заболевания. Другими словами, эти методы не являются безусловным доказательством этиологической значимости выявленного возбудителя в патологическом процессе. В то же время ПЦР очень подходит для массовых скрининговых исследований, для эпидемиологического анализа.
3) Интерпретация результатов
При скрининге как манифестных форм инфекции, так и латентных и бессимптомных форм почти идеальными являются методы молекулярного тестирования. Однако, несмотря на высокую информативность и чувствительность метода ПЦР, нередко возникают сложности с интерпретацией его результатов, особенно если больной неоднократно обследовался в разных лабораториях различными методами, так как могут быть ложноположительные и ложноотрицательные результаты, которые обусловлены разными причинами, например:
- выявление ДНК или РНК часто не означает развития инфекционного процесса в организме;
- нередко проводится поиск всего 1-2 возбудителей, и на основании такого обследования делается абсолютно необоснованный вывод об особой значимости или ведущей роли той или иной инфекции в неонатальной патологии и смерти;
- диагностические исследования биопроб на микоплазмы и уреаплазмы от пациентов только с помощью ПЦР, по всей вероятности, могут приводить к получению ложноположительных результатов.
Диагностическая ценность ПЦР повышается при сочетании с серологическими методами.
Наличие антител при отрицательных результатах прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) или ПЦР может быть связано с ранее перенесенной инфекцией («антитела-свидетели») либо с локализацией возбудителя в органах, недоступных для взятия материала. Отсутствие антител на фоне положительной ПИФ или ПЦР может указывать на самое начало инфекционного процесса, когда антительный ответ еще не развился, на латентную инфекцию, а также может быть следствием иммуносупрессии или слабой иммуногенности возбудителя.