Наиболее информативным серологическим методом является иммуноферментный метод (ИФА). Метод основан на определении антител классов IgM, IgA, IgG, специфичных для той или иной инфекции, или антигенов соответствующих возбудителей. В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Результаты данного исследования позволяют оценить состояние противомикробной защиты, на фоне которого развиваются ВУИ.
Гуморальный иммунитет обеспечивается иммуноглобулинами, которые представляют собой характерный продукт секреции В-лимфоцитов на конечной стадии их дифференцировки, т. е. плазматических клеток. Основной биологической функцией иммуноглобулинов является специфическое распознавание и элиминация антигена.
Характеристика классов иммуноглобулинов:
IgM - наиболее ранние антитела, поскольку первыми образуются на ранних стадиях инфекционного процесса. Это маркеры острого инфекционного процесса. Период полураспада - 5 сут. Они способны агглютинировать бактерии, нейтрализовать вирусы, активировать комплемент и играют важную роль в элиминации возбудителя из кровеносного русла. Не проникают через плаценту, синтезируются еще у плода и относятся к собственным антителам новорожденных. Их наличие (выявление) указывает на заражение (в том числе и внутриутробное), свидетельствует об активном процессе. Уровень IgM- антител иногда может повышаться при реактивации, реинфицировании или суперинфицировании герпес-вирусами, но не токсоплазмами.
В качестве иммунологического критерия ВУИ считается наличие специфических IgM в любом титре, что свидетельствует о первичном иммунном ответе плода или новорожденного на соответствующий бактериальный/вирусный антиген и может быть косвенным признаком инфекции. В тоже время, отсутствие специфических иммуноглобулинов класса М в сыворотке крови новорожденных не исключает возможность внутриутробной или интранатальной инфекции. Наличие у матери и новорожденного антител класса IgM подтверждает инфицирование плода в последний месяц беременности и интранатально.
IgA включают в себя два вида специфических белков: сывороточный и секреторный. Антитела класса А синтезируются в основном лимфоцитами слизистых оболочек в ответ на местное воздействие антигена, осуществляют защиту слизистых оболочек от патогенных микроорганизмов, потенциальных аллергенов и аутоантигенов. Период полураспада IgA - 6-7 сут. IgA не проходят через плаценту, что позволяет оценивать факт их выявления у новорожденных детей как критерий заражения. Секреторный IgA содержится в молоке, молозиве, слюне, в слезном, бронхиальном и желудочно-кишечном секрете, желчи, моче. Это основной вид иммуноглобулинов, участвующих в местном иммунитете. Селективное накопление IgA в секретах говорит о его защитной функции по отношению к возбудителям инфекции. При повышении его содержания в соответствующих секретах снижается накопление и выделение возбудителя, ограничивается развитие патологического процесса. Синтез сывороточных IgA начинается с конца 1-го месяца заражения и продолжается до тех пор, пока антиген доступен иммунокомпетентным клеткам. Его обнаружение свидетельствует об остром или подостром процессе, реактивации и суперинфекции. Тест показателен при диагностике врожденных форм инфекции (токсоплазмоз, ЦМВИ, ВПГ-инфекция, ВЭБ- инфекция), поскольку IgA не проходят через плаценту, а вырабатываются в организме ребенка в ответ на воздействие инфекционного агента.
IgG играют основополагающую роль в гуморальном иммунитете при инфекционных заболеваниях, вызывая гибель возбудителя с участием комплемента и опсонизируя фагоцитарные клетки; составляют основную часть всех иммуноглобулинов (80%) человека. Наибольшее значение в противоинфекционной защите имеет субкласс IgG2. IgG проникает через плаценту и формируют антиинфекционный иммунитет у новорожденных. В последние годы появилась возможность определения так называемых ранних специфических IgG, которые обладают низкой авидностью и указывают на первичную инфекцию. Высокоавидные антитела являются показателем давнего инфицирования и ранее перенесенной инфекции. Авидность антител в сыво­ротках оценивают по индексу авидности (ИА). На 8-12-й день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться анти-IgG. Они являются основным защитным фактором у ребенка первых недель жизни, так как прони­кают через плацентарный барьер в сыворотку плода. При грудном вскарм­ливании данные антитела из молока через слизистую оболочку кишечника новорожденного проникают в его кровь. Период полураспада - 21-24 дня.
Роль иммуноглобулинов разных классов в диагностике ВУИ:
- специфические IgM - ранние антитела, маркеры острого инфекционного процесса; не проникают через плаценту, синтезируются еще у плода и относятся к собственным антителам новорожденных;
- специфические IgA - не проходят через плаценту, результат иммунного ответа ребенка; свидетельствуют об остром или подостром процессе, реактивации и суперинфекции (при токсоплазмозе, ВЭБ-инфекции);
- специфические IgG - высоко- и низкоавидные (выявленные только специфические IgG указывают на их пассивную передачу от матери).
Авидность является косвенным признаком функциональной активности антител. Авидность антител оценивают с помощью индекса авидности, который представляет собой отношение результата определения общей концентрации IgG-антител в пробе к результату измерения концентрации высокоавидных IgG- антител в пробе. В острый период развития инфекции сначала образуются специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела, которые обладают поначалу низкой авидностью (достаточно слабо связывают антиген), затем идет синтез высокоавидных IgG-антител (более прочно связывающихся с антигенами). Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента.
Развитию бактериальных и вирусных инфекционно-воспалительных забо­леваний у новорожденных и, особенно, у недоношенных детей способствуют:
1) малая трансплацентарная передача материнских IgG до 35-36 неделе гестации;
2) неспособность В-лимфоцитов плода и новорожденного к переключению синтеза иммуноглобулинов класса IgM на IgG;
3) повышенное потребление иммуноглоблинов в раннем периоде адаптации при колонизации кожи и слизистых оболочек микрофлорой окружающей среды;
4) апоптоз незрелых В-лимфоцитов новорожденных при массивной микробной инвазии.
Очевидно, что в части случаев попадание инфекционного агента в плод не ведет к острой внутриутробной инфекции за счет включения в процесс защитных факторов, таких как материнские антитела и антитела плода, интерфероны матери и плода и плацентарный интерферон. Инфекция внутриутробно развивается у плода как хроническая или персистирующая. В то же время рождение как стрессорная реакция для новорожденного может активировать хроническую или персистирующую внутриутробную инфекцию с развитием обострения в первые недели после рождения. Такое обострение, как правило, приводит к поражению ЦНС, так как вероятность попадания возбудителя в мозг внутриутробно чрезвычайно высока из-за большей биомассы мозга, в сравнении с другими органами и незрелостью гематоэнцефалического барьера.
Для получения достоверных результатов серологического
обследования и правильной их трактовки необходимо:
1. Соблюдать определенные правила - серологическое
обследование должно проводиться:
- до введения препаратов донорской крови (плазмы, иммуноглобулинов и др.);
- одновременно с серологическим обследованием матерей, так как результаты обследования ребенка всегда необходимо сопоставлять с результатами обследования матери (для уточнения генеза происхождения антител - «материнские» или «собственные»);
- количественное определение специфических антител классов IgM, IgA, IgG - с целью уточнения активности инфекционного процесса;
- обязательное определение авидности специфических анти-IgG
- методом «парных сывороток» с интервалом в 14-21 день - с использованием одной и той же методики в одной и той же лаборатории (для определения нарастания или снижения титра антител в динамике)
Следует особо отметить, что в тех случаях, когда после первоначального обследования ребенку вводились препараты крови, исследование парных сывороток не проводят.
2. Интерпретация результатов серологических иследований
При оценке результатов серологических исследований необходимо учитывать:
1) Возможные особенности характера и фазы иммунного ответа у новорожденного.
2) Клинические данные и показатели других лабораторных исследований.
3) Серологическими маркерами острой фазы инфекционного процесса являются IgM, IgA и низкоавидные IgG, с нарастанием их титров в динамике.
4) Изолированное выявление антител класса IgG в сыворотке крови новорожденного без уточнения индекса авидности (а также независимо от авидности) и сопоставления с материнскими титрами не позволяет однозначно трактовать полученные данные, так как антитела могут иметь материнское происхождение (поступление в организм плода за счет трансплацентарного их переноса).
5) Однократное серологическое исследование новорожденных на наличие антител малоинформативно, это связано с особенностями иммунного ответа (ложноотрицательные результаты) и присутствием в крови новорожденных материнских антител.
Только при динамическом (с интервалом в 14-21 день) сравнении уровней специфических IgG-антител новорожденного ребенка и матери можно судить об их природе.
6) Определение только специфических антител классов IgM и IgG нередко приводит к гипо- или гипердиагностике (титры антител имеют тенденцию сильно колебаться в ходе инфекции, так что их резкое снижение или повышение не всегда коррелирует с активностью инфекционного процесса).
Отмечено, что у 40% детей с врожденной краснухой низкоавидные антитела IgG выявлялись до 3 лет (вместо 6 месяцев)
7) Как отсутствие у новорожденного специфических антител не означает отсутствия инфекции, так и наличие специфического IgG может быть связано с передачей его от матери.
8) Рекомендуемый принцип динамического наблюдения с целью определения 4-кратного нарастания титра антител в парных сыворотках при мониторинге ВУИ в большинстве случаев неоправдан. Авторы связывают это со следующей причиной: нередко пациентов обследуют на высоте иммунного ответа с развитием инфекционного синдрома или их иммунная система не способна вырабатывать антитела в достаточном количестве даже при наличии активной инфекции (вследствие иммунодефицита и иммунологической толерантности); а также слабой иммуногенности возбудителя.
9) Сероконверсия (появление специфических антител у ранее серонегативного пациента или нарастание титров антител в динамике) появляется позже дебюта клинических проявлений инфекции и выявления прямых маркеров репликации, например, ЦМВ (виремии, ДНК-емии, АГ-емии).
10) Возможны несоответствия титров антител и клинических вариантов болезни. Например, очень высокие титры антител к токсоплазмам у здоровых детей, отсутствие данных антител у новорожденных, недоношенных, детей первых месяцев жизни.
Специфические антитела класса IgM и IgA:
11) Наличие специфических иммуноглобулинов класса IgM в любом титре свидетельствует о первичном иммунном ответе плода или новорожденного на соответствующий бактериальный/вирусный антиген и может быть косвенным признаком инфекции.
12) Уровень IgM-антител может повышаться при реактивации, реинфицировании или суперинфицировании.
13) Первичный иммунный ответ реализуется в основном за счет анти-
IgM, которые при рождении могут не обнаруживаться и появляться позднее. Отрицательные или слабоположительные результаты не исключают врожденной инфекции и обусловлены незрелостью системы
иммунологической защиты. Необходимы повторные обследования.
14) Если ребенок получил материнские антитела анти-IgM через дефекты плаценты, то их титр резко снижается в первую неделю после рождения вследствие короткого периода полувыведения (5 сут).
15) У новорожденных специфические анти-IgM часто не выявляются даже при наличии вируса.
Например, специфические анти-IgM были выявлены у 31,4% детей с врожденной краснухой, что подтверждает частое формирование
иммунологической толерантности у новорожденных. Есть данные, что при диагностике ЦЫВИ определение анти-IgM дает около 50%
ложноотрицательных результатов. Присутствие анти-IgM может быть замаскировано высокой концентрацией материнских анти-IgG. Отсутствие специфических IgM в сыворотке крови новорожденных при ряде заболеваний (в том числе при неонатальном герпесе) не исключает возможность внутриутробной (интранатальной) инфекции.
16) Выявление специфических IgM или повышение титра низкоавидных АТ в пуповинной крови свидетельствует о внутриутробном контакте плода с соответсвующим микроорганизмом, но не доказывает того, что данный микроорганиз - причина инфекционного заболевания, то есть можно утверждать о внутриутробном инфицировании плода, но не обязательно о внутриутробной инфекционной болезни. Ряд авторов указывают также на способность возбудителей TORCH-группы подавлять иммунный ответ плода и новорожденного, что уменьшает диагностическую ценность серологических методов исследования.
17) Антитела класса IgM к ВПГ и GMB могут свидетельствовать об острой инфекции, но часто не выявляются при иммунодефицитных состояниях и при незрелом иммунитете у новорожденных. С другой стороны, ГВ вызывают нарушения иммуногенеза, приводящие к длительной циркуляции анти-IgM в отсутствие активной формы заболевания.
18) Специфические антитела IgM выявляются лишь у 1/3 инфицированных новорожденных - по следующим причинам:
- иммунорезистентность GMB во внутриутробном периоде способствует подавлению выработки собственных антител. У инфицированных новорожденных IgM выявляются крайне редко, их детекция становится возможной через месяц после рождения и позже.
Например, специфические IgM к краснухе выявляются только у 1/3 новорожденных с диагностированной врожденной краснухой;
- ВУИ развивается на фоне иммуносупрессии, и возбудители усугубляют это состояние
- многие внутриклеточные микроорганизмы являются слабыми иммуногенами, антигенная стимуляция невелика, поэтому антительный ответ на них развивается недостаточно
Например, из-за низкой иммуногенности у 50% больных хламидиозом антитела не обнаруживают; обнаружение антител к микоплазмам не имеет прогностического значения.
Специфические антитела класса IgG:
19) Антитела класса IgG проникают из крови матери через плаценту и формируют антиинфекционный иммунитет у новорожденного. Высокий уровень IgG-антител защищает плод от инфекции. Например, анти-IgG обеспечивают кратковременную защиту (до 6 мес) от повторного заражения хламидиями.
20) Однократное определение уровня IgG-антител в сыворотке не имеет клинического значения. Важно наблюдать за динамикой изменения уровня антител (нарастание или снижение).
21) Авторы отмечают необходимость подтверждения результата повторным исследованием, желательно с использованием другого метода и повторно взятого образца. Высокая авидность специфических анти-IgG исключает первичную инфекция, однако низкая авидность не всегда свидетельствует о первичной инфекции.
22) Определение активности инфекционного процесса по авидности IgG у детей может иметь ложноположительный результат в случае, если мать перенесла первичную инфекцию в сроки до 100 дней от инфицирования, так как ее низкоавидные антитела могут поступать к ребенку.
23) Феномен внутриутробно индуцированной иммунологической толерантности к «своим» и «чужим» антигенам («терпимости» к чужеродному агенту), развивающийся в следствие:
- незрелости иммунной системы у новорожденных детей;
- иммунодепрессивных свойств вирусов.
Предполагается, что в некоторых случаях внутриутробного инфицирования (в том числе и при ЦМВИ) иммунная система плода воспринимает АГ-детерминанты возбудителя как свои собственные, что сопровождается развитием к ним ИТ, поэтому возможен неадекватный специфический анти-ЦМВ иммунный ответ (инфицирование ЦМВ не сопровождается эффективным синтезом анти-ЦМВ, «отсроченное» образование специфических антител). По этой причине серологическое исследование новорожденного может быть ложноотрицательным.
24) Другим обстоятельством, не позволяющим исключить ВУИ при отрицательных серологических реакциях у новорожденного, является инфицирование во время родов. Следует помнить, что при тяжелых формах, сопровождающихся гибелью ребенка, также не отмечается нарастания титра антител.
25) Антитела класса IgG могут быть обнаружены в крови новорожденных в первые месяцы после рождения. Обнаружение только анти-IgG у детей до 3-6 месяцев жизни не является информативным. Их выявление не всегда свидетельствует в пользу инфицирования ребенка и может быть следствием пассивного переноса через плаценту из организма матери. Высокий уровень антител может иметь место как у практически здоровой женщины, так и у страдающей рецидивирующей формой инфекции.
Интерпретация результатов исследования сывороток новорожденного и матери:
1) Выявленные анти-IgG ребенка необходимо сопоставлять с уровнем анти-IgG у матери, что связано с возможностью их трансплацентарной передачи, без этого сравнения возможна ложноположительная трактовка выявленных анти-IgG.
2) Если концентрация и индекс авидности специфических анти-IgG у ребенка при рождении равны или меньше титра соответствующих материнских антител, и при повторном исследовании через 3-4 недели - снижаются в 1,5-2 раза, то определяемые у ребенка IgG являются материнскими (свидетельствует не о внутриутробной инфекции, а о трансплацентарной передаче материнских антител).
3) Диагноз ВУИ становится весьма вероятным при превышении уровня суммарных антител в 4 и более раз над уровнем антител в сыворотке крови матери или, если при повторном исследовании крови ребенка в первые месяцы жизни уровень анти-IgG не снижается (катаболизм материнских иммуноглобулинов в организме ребенка с периодом полураспада 16-26 дней).
4) Процент совпадений положительных результатов ИФА у матерей и ПЦР у новорожденных при ЦМВ - 46%.
5) Обнаружение только IgG-tox требует проведения повторного исследования через 4-6 недель: концентрация материнских антител должна снизиться на 40% и более; отсутствие снижения или нарастания IgG-tox позволяет подтвердить диагноз токсоплазмоза.
Таким образом, при серологической диагностике ВУИ, особенно у недоношенных детей, наиболее значимыми являются:
- наличие в сыворотке крови новорожденных материнских антител, переданных трансплацентарно;
- иммунологическая толерантность (с формированием длительной персистенции возбудителя и реактивации в постнатальном периоде);
- выраженная незрелость иммунитета, которая обусловливает неадекватность иммунного реагирования;
- способность возбудителей TORCH-группы подавлять иммунный ответ;
- при большинстве процессов, вызываемых внутриклеточными возбудителями, антигенная стимуляция невелика (например, из-за низкой иммуногенности у 50% больных хламидиозом антитела не обнаруживают).
Поэтому, отсутствие у новорожденного специфических антител не означает отсутствие инфекции, а наличие специфического IgG может быть связано с передачей его от матери.
Особенности интерпретации результатов серологических исследований в отношении наиболее часто определяемых возбудителей ВУИ (по обзору современной литературы):