Специфический активный иммунитет
Специфический иммунитет к возбудителям холеры, как показали проведенные нами исследования, является полифак- торным [Адамов А.К. и др., 1968—1979]. К этому же мнению пришли R.H.Waldman и соавт. (1971), D.Rowley (1974), l.Knop,
D. Rowley (1975) и др. Все иммунные механизмы [Адамов А.К., 1981] объединяют в 8 общих факторов (иммуноинформацион- ный, иммуноклеточный, антительный, гуморальный, арецеп- торный, функциональный, выделительный и регуляторный) и 8 местных факторов (иммунотканевый, арецепторный, гуморальный, органный, выделительный, функциональный, микрофлорный и регуляторный).
Многие исследователи считали, что основными защитными механизмами в кишечнике служат фагоцитоз, комплемент и кишечные антитела (копроантитела). Однако проведенные нами исследования показали, что иммунитет обусловлен сложными молекулярными и клеточными эффекторными механизмами, причем в специфической защите участвуют не только иммунокомпетентные клетки, но и энтероциты [Адамов А.К., 1989] и, по-видимому, макрофаги [Покровская М.П. и др., 1964; Кириличева Г.Б. и др., 1989; Dodin A. et al., 1972]. В формировании клеточных защитных механизмов против холерных вибрионов активно участвуют лимфоциты [Кузнецова О.Р. и др., 1976; Самострельский А.Ю. и др., 1978], в том числе Т- и В-лимфоциты [Рубцов И.В. и др., 1975; Ледванов М.Ю. и др., 1986, 1987, 1988, 1989; Соболев С.М., Степанова Т.Н., 1987;
Герасимова К.И. и др., 1988; Козырева Л.А., Сорокин Т.Б., 1988; Соркин Т.Б., Козырева Л.А., 1988; Richardson S.H., Kuhn R., 1986; Warner G.L. et al., 1989]. В лимфоидных образованиях кишечника обнаружены Т-супрессоры и Г-контрсуп- рессоры [Lamont A.G. et al., 1987]. Холерный экзо- и анатоксин при парентеральном введении вызывают формирование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Горская Е.М. и др., 1980; Fujisawa Н. et al., 1987; Kay R.A., Perguson А., 1989].
Парентерально введенный антиген поглощается макрофагами и после переработки презентуется стволовым клеткам с последующим формированием В-лимфоцитов, продуцирующих антитела.
При пероральном введении антигенов их захватывают М-мем- бранные клетки эпителия, покрывающего групповые лимфатические фолликулы (пейеровы бляшки). Затем, вероятно, после частичной ферментной обработки они поступают в макрофаги. Из М-клеток антигены, по-видимому, могут передаваться в звездчатые (дендритические) клетки собственной пластинки слизистой оболочки или в макрофаги, а затем в дендритические клетки. Из макрофагов и дендритических клеток антигены могут презентоваться Г-лимфоцитам. Взаимодействие этих клеток происходит, вероятно, при участии молекул главного комплекса гистосовместимости МНС класса И.
По данным R.L.Owen и соавт. (1986), М-клетки захватывают живые вибрионы и не захватывают убитые.
N.Lycke и J.Holmgren (1989) в экспериментах на мышах линии G57BL/6 установили, что через 1 год после премирующей пероральной иммунизации холерным экзотоксином переносили сингенным животным клетки брыжеечных лимфатических узлов и селезенки. Реципиенты после переноса им клеток приобретали способность реагировать на пероральное заражение холерным экзотоксином образованием клеток — продуцентов антитоксинов. У реципиентов перенесенные клетки обнаруживались в брыжечных лимфатических узлах, селезенке, в собственной пластинке слизистой оболочки кишечной стенки, но не в пейеровых бляшках. Независимо от источников клеток памяти в кишечнике они образовывали клон клеток — продуцентов IgA-антител, в селезенке — IgG-антител. Предварительная перед введением реципиенту обработка клеток памяти моноклональными антителами k Л Id и комплементом устраняла клетки памяти. Клоны — продуценты антител в организме реципиента не образовывались. Обработка моноклональными антителами к Thy. 1.2 и комплементом не оказывала влияния на клетки памяти.
Иммунитет после перенесенного заболевания холерой сохраняется к гомологичному серовару до 12 мес, к гетерологичному—до 6 мес [Адамов А.К., 1981; Ghosh А.К., 1974].
Данные отечественных и зарубежных исследователей гуморального механизма иммунитета [Коробкова Е.И., 1959; Адамов А.К., 1980, 1981, 1982; Pollitzer R., 1960] подтверждены, углублены и расширены другими исследователями [Оленичева Л.С, Непомнящая Н.Б., 1984; Бугоркова Т.В., Наумшина М.С., 1987; Генова Ю.Г. и др., 1987; Наумшина М.С. и др., 1987; Курбанов Ш.Х., Тепляков А.Б., 1987; Сагеева О.Ф. и др,, 1987, 1988; Шахламов Э.Н., Буравков С.В., 1987; Эмдина И.А. и др., 1987; Белов Л.Г., 1988; Белов Л.Г. и др., 1988; Глянь- ко Е.В., Авроров В.П., 1988; Грачев Ю.А. и др., 1988; Кароль В.В., Гофман Е.Л., 1988; Либинзон А.Е. и др., 1988, 1988а; Малы- хина З.В. и др., 1988; Тюменцев С.Н. и др., 1988; Куличен- ко М.А. и др., 1989].
N.F. Pierce и соавт. (1988) считают, что иммунные механизмы при холере направлены против заселения кишечника холерными вибрионами. По другим данным, иммуногенные штаммы холерных вибрионов вызывают формирование механизмов, блокирующих адгезию вибрионов к энтероцитам и подавляющих размножение их в кишечнике [Адамов А.К. и др., 1973, 1975, 1980-1990].
На молекулярном уровне защитное действие общих и местных факторов иммунитета обусловлено взаимодействием антител против структурных антигенов, ферментов и токсинов холерных вибрионов с ферментами и модуляторами метаболических циклов клеток макроорганизма [Адамов А.К. и др., 1990]. Основу молекулярной иммунологии холеры составляют механизмы, которые могут быть объединены в семь групп (табл. 103, 104). Они обеспечивают следующие функции иммунной системы:
• информационно-регуляторные: распознавание холерных вибрионов и их антигенов, а также регулирование их обезвреживания;
• арецепторные: блокирование адгезии холерных вибрионов к энтероцитам и связывание токсинов с рецепторами;
• барьерные: предупреждение проникновения вибрионов к энтероцитам и в ткани кишечника;
• подавление размножения вибрионов посредством иммунных циклов, состоящих из антител к структурным антигенам холерных вибрионов, ферментам и модуляторам клеток макроорганизма;
• подавление размножения вибрионов с помощью антифер- ментных иммунных циклов, состоящих из антител к ферментам холерных вибрионов, ферментам и модуляторам клеток макроорганизма;
• нейтрализацию токсинов холерных вибрионов посредством антитоксических иммунных молекулярных циклов, включающих антитоксины, ферменты и модуляторы клеток макроорганизма;
• выведение антигенов или продуктов их распада из организма;
• обеспечение функционирования перечисленных механизмов и компенсирования повреждений, вызванных холерными вибрионами [Адамов А.К., 1981].
Таблица 103
Основные антивибрионные иммунные молекулярные циклы противохолерного иммунитета
Примечание. Условные обозначения указаны в тексте. |
Иммунные молекулярные циклы включают два компонента: специфический и неспецифический. Антитела, специфический компонент иммунных циклов, управляют действием неспецифических компонентов циклов. Как известно, под влиянием холерных антигенов в организме образуются IgM-, IgA- и IgG- антитела, которые выполняют различные функции.
Антитела IgM и IgG активируют комплемент в другие неспецифические компоненты иммунных циклов. Антитела
Основные антитоксические иммунные молекулярные циклы противохолерного иммунитета
|
класса IgA обладают антитоксической активностью и, как показали А.К.Адамов и соавт. (1977),—антиферментной активностью.
В тонкой кишке животных преобладают секреторные IgA- антитела и из крови поступает значительное количество антител класса IgG. Согласно данным R.J.Yancey и соавт. (1979), полученным в экспериментах с антителами против IgG и IgA, в местных механизмах иммунитета важны антитела обоих классов. Подавление образования антител класса IgA или IgG с помощью соответствующих антител незначительно снижало местный иммунитет. При подавлении антител обоих классов иммунитет утрачивался.
Модельные эксперименты с очищенными препаратами компонентов метаболических циклов животных и человека, а также опыты на животных [Адамов А.К. и др., 1976—1990] показали, что ведущими в подавлении жизнедеятельности вибрионов являются две группы иммунных циклов: IV и V (см. табл. 103). К IV группе иммунных циклов, которые обладают антивибрионной активностью, относятся следующие:
В указанных циклах Ag — антитела к О- и Н-(структурным) антигенам холерного вибриона; Хв — холерные вибрионы;— вибриоцидный эффект при определенном значении pH; Ij — замедление размножения.
Группа V иммунных циклов, также проявляющая антивиб-
рионную активность, объединяет антиферментные циклы, состоящие из антител к структурным антигенам или трофическим ферментам холерных вибрионов, и компоненты метаболических циклов клеток животных.
В экспериментах установлено существование двух антифер- ментных иммунных циклов, подавляющих размножение холерных вибрионов:
В этих циклах АГа — антитела к холерной АТФазе; Afx — антитела к неизвестным ферментам холерного вибриона (вероятно, к некоторым ферментам гликолитического цикла).
Группа VI иммунных циклов (см. табл. 104), характеризующаяся антиэкзотоксической активностью, объединяет следующие иммунные циклы:
В этих циклах АЬ — антитоксины; Сг — холерные токсины; 10 — нейтрализация токсинов;— разрушение токсинов.
Необходимо отметить, что в приведенных молекулярных циклах взаимодействие антител с ферментами проявляется при разведении сывороток 1:250 и выше.
Группа VII иммунных циклов, существование которых предполагается, обусловливает связывание некоторых фрагментов антигенов гликолипидами и сегрегацию их в гранулы клеток иммунной системы:
В этих циклах А — антитела к антигенам холерных вибрионов;— антигенные фрагменты; РБ — белок гликолипид; 1т — сегрегация.
Опыты на животных позволяют предположить, что иммунные циклы IV (3, 4, 6, 7), V (2, 3) и VI (1, 2, 3) функционируют в полости тонкой кишки; IV (1, 4, 5—7), V (1, 2) и VI (1, 2, 3) - в энтероцитах; IV (1-7), V (1-3), VI (1, 3) и VII — в фагоцитах; IV (1), V (2, 3) и VI (1—3) —в плазме крови.
Механизмы общих факторов иммунитета при иммунизации существующими вакцинами формируются достаточно активно [Адамов А.К. и др., 1972; Адамов А.К., 1980, 1981; Назарова
Л.С., 1981], за исключением антиферментных иммунных циклов.
Ведущими в защите от холерных вибрионов являются местные факторы иммунитета. Местные — иммунотканевый и арецепторный — факторы направлены на предупреждение адгезии холерных вибрионов к энтероцитам и разрушение клеток холерных вибрионов. Холерные вибрионы, попадая в тонкую кишку человека, чтобы вызвать заболевание, должны адгезироваться на энтероцитах. Токсин также вызывает патологический процесс только после связывания с клеточными рецепторами. Механизмы, направленные на блокирование адгезии и взаимодействия токсина с рецептором, объединены нами в арецепторный фактор.
Согласно сообщению E.S. Fubara и R.Freter (1973), адгезия вибрионов на энтероцитах зависит от активности в них гликолиза. При ингибировании гликолиза количество адгезиро- вавшихся вибрионов на энтероцитах возрастает. В иммунном организме адгезию вибрионов подавляют антитела к О- и Н-ан- тигенам [Клюхин С. и др., 1927; Самострельский А.Ю. идр., 1978; Freter R., 1969—1974]. Расчеты, произведенные нами по данным W.Chaicumpa и D.Rowley (1972), показали, что для подавления адгезии необходимо, чтобы в содержимом тонкой кишки титр антител к О-антигенам был не ниже 3-106 BE. Для подавления адгезии у человека ему требуется ввести перорально 3 * 109 BE.
Как показали исследования на животных, практически невозможно путем активной иммунизации обеспечить содержание вибриоцидных антител в кишечном секрете в титре, равном 3- 106 BE. Поэтому только этот механизм защиты не может обеспечить невосприимчивость организма к холерной инфекции [Адамов А.К., 1980].
Кроме антиадгезивного действия антител, существенным механизмом арецепторного фактора является блокада антитоксинами связывания токсина с рецепторами энтероцитов. Активной частью рецептора является ганглиозид Gml. Кроме того, нами установлено, что при иммунизации холерным анатоксином в энтероцитах уменьшается содержание гангли- озида Gml [Адамов А.К., Павлова Ю.П., 1979]. При вакцинации возможны следующие механизмы снижения активности рецепторов в энтероцитах: 1) уменьшение синтеза ганглиози- да Gml; 2) полимеризация ганглиозида Gml с образованием димеров и более сложных его полимеров, не связывающих экзотоксин; 3) усиленное выделение из энтероцитов ганглиозида Gml. При иммунизации морских свинок мы наблюдали в крови увеличение концентрации ганглиозидов, не связывающих холерный экзотоксин.
Одновременно с механизмами, блокирующими адгезию, в энтероците функционирует сорбционный механизм, который, по нашим представлениям, способствует разрушению холерных вибрионов. При этом для разрушения холерных вибрионов энтероциты адсорбируют их на микроворсинках в определенных зонах, где функционируют иммунные молекулярные циклы, вызывающие гибель холерных вибрионов. Иммунный энтероцит в этих зонах цитоплазматической мембраны содержит специфические антитела и функционирует как своеобразный иммуносорбент. На поверхности цитоплазматической мембраны (см. табл. 103 и 104), вероятно, функционируют I, IV—1, 2, 3, 4, 5; V—1, 2, 3 и VI — 1—3 иммунные молекулярные циклы [Адамов А.К., Малыхина З.В., 1978]. По-видимому, указанные механизмы обеспечивают бактерицидное действие слизистой оболочки тонкой кишки иммунных животных, обнаруженное R.Freter (1969—1974), E.S. Fubara и R.Freter (1973), W.Chaicumpa и соавт. (1972), I.Knop и R.Rowley (1975), а также подавление подвижности, отмеченное J.Knop и J.E. Bellamy (1976). Живые изолированные энтероциты совместно с антителами также действуют вибрио- цидно [Freter R., 1970]; мертвые энтероциты — слабо ингибируют размножение вибрионов [Адамов А.К. и др., 1977]. При нарушении кровоснабжения слизистой оболочки бактерицидное действие ее снижается. Эти данные подтверждают существенную роль неспецифического компонента в иммунных циклах и бактерицидное действие слизистой оболочки тонкой кишки.
Гуморальный местный фактор объединяет защитные механизмы кишечного секрета. В нем, по-видимому, функционируют (см. табл. 104 и 105) иммунные циклы: II, III, IV — 2, 4; V — 2, 3 и VI. Антитела, содержащиеся в кишечном соке, блокируют адгезию вибрионов к энтероцитам.
Слизь, содержащая антитела к О- и Н-антигенам, выполняет роль барьера, замедляющего продвижение холерных вибрионов к энтероцитам. Согласно сообщению G.D.Schrank и W.F.Uerwey (1976), если слизь содержит антитела, то холерные вибрионы не могут проникнуть через этот барьер к микроворсинкам энтероцитов. Вблизи ворсинок, где концентрация антител и ферментов высокая, они наблюдали подавление размножения холерных вибрионов.
Содержимое тонкой кишки — химус, в котором много клетчатки (целлюлозы), также выполняет защитную функцию путем адсорбции на частицах клетчатки холерных вибрионов и, вероятно, их токсинов. В иммунном организме клетчатка в тонкой кишке содержит и антитела. В связи с этим ее можно рассматривать как подвижный иммуносорбент.
В экспериментах на белых мышах I.Knop и D.Rowley (1975) установили, что у иммунных животных холерные вибрионы быстрее элиминируются из тонкой кишки в толстую.
Взаимодействие иммунотканевого, арецепторного, гуморального и регуляторного местных факторов иммунитета координируется кишечником — органом, для которого характерен элиминационно-хроматографический фактор. Кишечник посредством перистальтики обусловливает перераспределение вибрионов по слизистой оболочке, с тем чтобы на каждый энтероцит сорбировалось, вероятно, не более 1 вибриона. При этом условии иммунные энтероциты способны умертвить холерный вибрион, адсорбировав его на своей цитоплазматической мембране в зоне действия иммунных молекулярных циклов. Органный фактор, следовательно, способствует перераспределению вибрионов в кишечнике (своего рода хроматографии), а также сорбции на энтероцитах и частицах химуса. Кроме того, органный фактор обеспечивает выведение их из тонкой кишки в толстую и во внешнюю среду. Органный элиминационно-хроматографический фактор мы рассматриваем как очень эффективный механизм защиты. Достаточно напомнить, что из организма тяжелобольного холерой посредством этого защитного фактора ежедневно выводится 2 ■ 1013 вибрионов (или примерно 0,5 г вибрионов).
Другие перечисленные выше местные факторы иммунитета еще только изучаются.
Следует подчеркнуть, что основу иммунитета к холере составляют антимикробные механизмы [Адамов А.К. и др., 1973, 1975; Адамов А.К. и др., 1981 — 1990; Адамов А.К., Адамов О.А., 1990; Pierce N.F. et al., 1988].
При иммунизации холерными вакцинами, так же как и в организме больного, формируется функциональная система искусственного иммунитета, которая обеспечивает своевременное распознавание проникших в организм возбудителей холеры и гармоническое активирование всех факторов иммунитета [Адамов А.К., 1981].
Для обеспечения защиты мобилизуются метаболические процессы, обеспечивающие иммунные механизмы необходимыми ферментными звеньями, модуляторами и энергией.
Метаболическая перестройка организма при формировании иммунитета чрезвычайно сложна. После многих почти безуспешных попыток, предпринятых в начале текущего столетия, исследования в этом направлении в последующие годы проводились не систематически. С 1968 г. в лаборатории института «Микроб» ведется изучение указанных проблем. В экспериментах установлено, что при иммунизации активируется метаболизм посредством адаптационных механизмов и механизмов, участвующих в реализации стресс-реакции [Горькова А.В. и др., 1972; Козырева Л.А. и др., 1984; Шанин И.В., 1987; Соболев С.М., Степанова Т.М., 1987; Щуковская Т.Н., Горькова А.В., 1988; Дмитриева В.П. и др., 1990; Адамова Г.В. и др., 1988; Мохин К.М. и др., 1989], причем активирование метаболизма направлено на генерирование энергии, которая используется для синтеза антител, разрушения антигенов, и на компенсирование изменений в организме с целью обеспечения нормальной его жизнедеятельности [Адамов А.К., 1970* Горькова А.В. и др., 1972; Назарова Л.С., 1981; Наумшина М.С. и др., 1987, 1989; Хакимов М.М., Абдулаев А.И., 1988].
Сложным и еще малоизученным следует признать материнский иммунитет. По-видимому, кроме специфических антител секретируемых с молоком, в формировании материнского иммунитета участвуют и некоторые ферменты, содержащиеся в молоке (лактопероксидаза и ряд других). В экспериментах на животных доказано, что молоко иммунизированных холерными антигенами коз и коров при пероральном введении защищает их от заболевания холерой [Адамов А.К., 1980; БЫшатига Т. ег а1., 1981; Воезтап-Нпке^ет М. а а1., 1989].
Формирование иммунных механизмов происходит под влиянием антигенов холерных вибрионов, относящихся к детерминантам вирулентности. По мнению А.К. Адамова (1975, 1980, 1981, 1984), холерные вибрионы содержат более 15 детерминант вирулентности: 1) антиген 1 (Н, подвижность); 2) положительный хемотаксин — детерминанта VI:; 3) детерминанта адгезии и межмембранного кооперативного взаимодействия — 8; 4) антиген-9 (термолабильный антиген, обеспечивающий защиту вибрионов от действия желудочного сока);
1) 8-форма колоний; 6) антиген 15 (слизь); 7) Р1 —комплекс транспортных ферментов; 8) Р1 — комплекс трофических ферментов; 9) Гб — констелляция деструктивных ферментов; 10) \У — вибриоцины; И) 1^ — комплекс ферментов, обеспечивающих деление клетки; 12) антиген 13 — энтеротоксин; 13) антиген 14 — мембранотоксин; 14) антигены 2, 3, 4 — экзотоксины; 15) сидерфор — белок, транспортирующий ион железа в клетку вибрионов.
При анализе возможности формирования иммунных механизмов под влиянием разных антигенов [Адамов А.К., 1981], инактивирующих указанные детерминанты, получены следующие данные. Подавление адгезии, подвижности и действия эндотоксина обеспечивают антитела к термостабильным О- антигенам 2, 3 и 4. Гемагглютинин не вызывает образования защитных механизмов [8уеппегЬо1ш А.-М. е! а1., 1983]. Антитоксины эффективно нейтрализуют холерные экзотоксины. Не исследована эффективность специфических антител в инакти- вировании вибриоцинов, антигена 9 и ферментов, обеспечивающих деление вибрионов. Инактивирование ферментов, входящих в детерминанты Р1, Р1 и Рс1, возможно иммунными антителами против этих ферментов. Однако они обладают слабыми антигенными свойствами. Антиферментные антитела, согласно гипотезе А.К. Адамова, занимают центральное место в формировании искусственного иммунитета к холере. Организм, блокируя с помощью антиферментных антител транспорт веществ в клетки вибрионов и некоторые метаболические процессы, обусловливает их гибель от дефицита энергии [Адамов А.К., 1975, 1980, 1981]. В связи с низкой антигенной активностью ферментов ведется углубленное изучение способов усиления иммуногенности ферментов, входящих в детерминанты Рг, Рс1 и другие неизученные детерминанты, а также поиски адъювантов для ферментов.
По мнению Д.Роули (1983), липополисахарид (эндотоксин) не играет существенной роли в формировании иммунитета к холере. Этот автор считает, что иммунитет к холере обусловлен действием экзотоксина и лабильных белковых антигенов. По нашим наблюдениям, формирование иммунитета происходит под влиянием антигенных детерминант вирулентности в оптимальных для иммуногенеза соотношениях [Адамов А.К., 1975, 1980, 1981].
Использование новых антигенных комплексов и ферментов при конструировании холерных вакцин требует разработки новых методов определения иммунологической перестройки организма.
Широко изученные О- и Н-антигены активируют с помощью образовавшихся против них антител иммунные молекулярные механизмы, эффективно функционирующие только при достаточно высоких титрах антител. Надежная защита лигированных петель тонкой кишки кроликов от заражения холерными вибрионами наблюдалась у животных, иммунизированных путем внутрижелудочного 3-кратного ежедневного введения по 40 мг убитых вибрионов и холерного анатоксина на 1 кг массы тела в течение 3 дней [Адамов А.К., Волоси- вец А.И., 1979, 1990]. Возможно, у животных, иммунизированных большими дозами микробных клеток, в индукции иммунных механизмов принимают участие не только О- и Н- антигены, но и еще неизвестные слабые антигены вибрионов, не проявляющие иммунологической активности при введении небольших доз убитых вибрионов.
По данным Т.ЬЫЬага и соавт. (1980), у мышей иммунитет к внутрибрюшинному заражению холерными вибрионами регистрировался только после ежедневных 3-кратных введений перорально по 30—60 мг убитых вибрионов на 1 кг массы тела. У мышей линии с!с^ он обеспечивал 100 % защиту, у животных других линий — от 14 до 60 %. В то же время в сыворотке крови не обнаруживались антитела к О- и Н-анти- генам.
В соответствии с приведенными данными, для формирования иммунитета у человека ему необходимо вводить ежедневно 50—60 мг антигенов холерных вибрионов на 1 кг массы тела в течение 3 дней (разовая доза в среднем 4—4,8 г на человека в день).
Многие исследователи в последние годы ведут поиск еще неизвестных антигенных детерминант и протективных антигенов. Так, согласно сообщениям В.Gustafsson и J.Holme (1983)
C. V.Sciortino и соавт., (1985), T.Ito и соавт., (1987), L.Zhu и Sh.Zhang (1988), липополисахарид из холерных вибрионов серовара Огава содержит антигенные детерминанты, общие для сероваров Огава и Инаба, а также серовароспецифичес- кую детерминанту Огава. Свойством агглютинировать холерные вибрионы обладали только антитела к липополисахари- дам О-видовому, Огава и Инаба [Sciortino C.V. et al., 1965]. Липополисахарид обладает слабой иммуногенностью [Forrest B.D. et al., 1989].
По данным J.Shimada и соавт. (1987), детерминанта серова- роспецифического антигена Инаба синтезируется в клетках
V. fluvialis группы 19.
Комплекс генов, кодирующих синтез О-антигенов холерных вибрионов, был клонирован Р.А. Monning и соавт. (1986) в штамме E.coli К-12. Посредством рестрикционного анализа клонов они обнаружили, что примерно 15 kb относились к общим О-антигенам клонов, последующие 15 kb содержали клоны Огава. Антитела к штамму К-12, содержащему клон рРМ 1001 (детерминанта холерного О-антигена Инаба), при пероральном введении защищали мышей-сосунков от перорального заражения холерными вибрионами.
У энтеропатогенных вибрионов с помощью холерной О-аг- глютинирующей сыворотки был обнаружен антиген, общий с антигеном холерных вибрионов (не относящийся к видовому и серовароспецифическим О-антигенам), который не вызывал у кроликов образования гомологических антител [Адамов А.К., Щуркина И.И., 1975]. По данным J.Shimada и соавт. (1987), детерминанта серовароспецифического антигена Инаба синтезируется в клетках V.fluvialis группы 19. Иммуноген- ность и свойства дермодекротоксина недостаточно изучены [Ефимцева Е.П., 1963; Помухина О.И., Уралева В.С. 1987, 1988, 1989; Исупов И.В. и др., 1990; Watanabe Y., Verwey W.F., 1965].
Среди белков наружной мембраны холерных вибрионов Sh.Kabir 0980), J.F.Kelley и Gh.D. Parker (1981), Т.А.Аболина и соавт. (1987) обнаружили слаботоксичные антигены с молекулярной массой 68 000, 48 000, 45 000, 1300. По данным A.Faris и соавт. (1982), S.Kabir и A.Showkat (1983), поверхностные белки, обладающие гидрофобными свойствами, способствуют адгезии холерных вибрионов.
H.Yamaguchi и соавт. (1986) с помощью иммуноэлектрофореза обнаружили новый перекрестно реагирующий белок у 11 видов бактерий, в том числе и в клетках холерных вибрионов. Он характеризовался молекулярной массой 60 000.
Sh.Kabir (1989) с помощью перекрестного иммуноэлектрофореза обнаружил в клетках холерных вибрионов 01 серо- вара 30 мигрирующих к аноду антигенов, одним из которых был липополисахарид. Большинство из них по свойствам относились к белкам. Часть из них располагалась на наружной мембране; основной белок наружной мембраны находился в тесной связи с липополисахаридом.
Согласно сообщению D.Sengupta и соавт. (1989), белки наружной мембраны ОМР холерного 01 серовара и не 01 серовара имеют много общего в антигенной структуре. Они обнаружили общие антигенные свойства у белков наружной мембраны с массой 36 000 и 25 000—26 000 холерных вибрионов 01 и не 01 серовара. Сыворотки против этих антигенов защищали кроликов от заражения их холерными вибрионами в лигированные петли тонкой кишки.
Используя моноклональные антитела, C.V.Sciortino и соавт. (1985), C.V.Sciortino (1989) выявили среди белков наружной мембраны холерных вибрионов, выращенных на агаре с мясным экстрактом, антиген ОМА с молекулярной массой 18 000. Моноклональные антитела против этого антигена при пероральном введении в смеси с холерными вибрионами защищали 90% животных от заболевания (в контроле 99% животных погибало), но в кишечнике полной гибели вибрионов не происходило. В содержимом кишечника они обнаруживались в концентрации 108 и выше. Причины этого явления остались необъясненными. Антитела против других 5 антигенов наружной мембраны и липополисахарида не защищали животных от заражения холерными вибрионами.
J.Pochlner и соавт. (1986), М.В. Jalajakumari и Р.А. Manning (1990) выявили последовательности нуклеотидов, кодирующие информацию о белках наружной мембраны холерных вибрионов с молекулярной массой 22 000.
По данным V.L. Miller и J.J. Mekalanos (1988), 2 основных белка наружной мембраны ОтрТ и OmpU находятся под контролем гена toxR. Экспрессия этих белков, токсина и ТсрА (пилевого фактора колонизации) зависит от концентрации аспарагина, аргинина, глутаминовой кислоты и серина. Температура и pH влияют преимущественно на экспрессию холерного токсина и ТсрА. По-видимому, перечисленные выше факторы служат регуляторными сигналами для гена toxR.
В капсуле жгутиков холерных вибрионов обнаружены 3 полипептида молекулярной массой 61 500, 60 000 и 56 500 [Hranit- zky K.W et al., 1980].
С помощью моноклональных антител T.Jto и T.Yokota (1987) установили, что холерные вибрионы синтезируют 2 типа антигенов: 1-й тип антигенов после прогревания не утрачивает свойства образовывать типичные агглютинаты; 2-й тип после прогревания вместо крупных образует мелкозернистые агглютинаты.
По данным G.Jonson и соавт. (1989), холерные вибрионы, выращенные в лигированных петлях тонкой кишки в нелиги- рованной тонкой кишке, экспрессировали 7—8 белков клеточной оболочки, не обнаруживаемых в вибрионах, культивируемых на обычных лабораторных средах. Некоторые белки, обнаруживаемые в наружной мембране выращенных in vitro вибрионов, в выращенных in vivo вибрионах обнаруживались в меньшем количестве. Новые белки не индуцировались при выращивании вибрионов в среде, лишенной железа, что указывает на их отличие от белков системы транспорта железа. Изменения профиля белков наружной мембраны при выращивании in vivo разных штаммов вибриона было закономерным. Новые белки обладали антигенными свойствами.
K.Richardson и соавт. (1989) исследовали с помощью им- муноблоттинга специфичность иммуноглобулинов в сыворотке и кишечном секрете людей — добровольцев, зараженных холерными вибрионами 01 серовара. Они установили, что в холерных вибрионах синтезируется 3 типа белковых антигенов: антиген i содержался в вибрионах обоих сероваров и биоваров; антиген и — в штамме, которым заражали добровольцев; антиген iii — в выращенных in vivo вибрионах. С этими антигенами, относящимися к белкам наружной мембраны клеток с молекулярной массой менее 25 000, реагировали сывороточные IgG- и секреторные IgA-антитела добровольцев.
H. Fujsawa и соавт. (1987) в опытах на мышах линии BALBC, иммунизированных холерной живой вакциной, обнаружили, что освобождение их кишечника от вибрионов происходит под управлением антител против нового антигена, синтезированного живой вакциной в организме этих животных, во время их иммунизации. Вероятно, новый антиген представляет собой фермент, выполняющий важную функцию в клетках вибрионов, активность которого подавляется антиферментными антителами.
Новый антиген у холерных вибрионов, образующийся в определенной питательной среде, открыли M.Ehara и соавт. (1986, 1989). Они же разработали методику выделения в очищенном виде субъединиц фимбрии холерных вибрионов и определили N-концевую последовательность аминокислот.
Токсин-корегулирующий антиген пили (TCP) обнаруживался только в классических холерных вибрионах, выращенных в определенных условиях [Sharma D.P. et al., 1989].
По мнению P.Manning (1987), образование протективных антител вызывают белки наружной мембраны холерных вибрионов, жгутиков и ЛПС, не вызывают — гемагглютинины.
Обширную группу термолабильных малоизученных антигенов представляют ферменты холерных вибрионов. В нашей лаборатории систематически ведется изучение иммуногенных свойств ферментов с целью использования их в качестве компонентов вакцины. В экспериментах на морских свинках и кроликах было установлено, что ферменты холерных вибрионов — каталаза, муциназа [Адамов А.К. и др., 1977, Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977; Адамов А.К. и др., 1980; Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1981], АТФ-аза [Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977; Майоров Н.В. и др., 1984], нейраминидаза, аль- долаза и фермент П ФЭП-зависимой глюкозотранспортной системы [Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1981; Адамов А.К. и др., 1982, 1983] обладают слабой антигенностью.
В сыворотке животных, которым подкожно вводили с 7- дневным интервалом 640, 1280 и 2560 ед. муциназы или 11,6, 23,2 и 56,4 ед. протеазы, антитела к ферментам обнаруживались в титрах, равных 400—600 антиферментных единиц в 1 мл (АФЕ/мл). Токсического действия ферментов не отмечалось [Адамов А.К. и др., 1977; Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977; Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1981].
Ферменты холерных вибрионов: АТФ-аза [Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977; Майоров Н.В. и др., 1984, 1987; Майоров Н.В., 1990], нейраминидаза, альдолаза и фермент П ФЭП- зависимой глюкозотранспортной системы [Адамов А.К. и др., 1982; Адамов А.К. и др., 1985] при подкожной иммунизации кроликов по схеме 0,15, 0,33 и 0,66 мг белка на 1 кг массы тела с 7-дневными интервалами между инъекциями вызывают накопление антиферментных антител в крови в титрах, не превышающих 10—30 АФЕ/мл.
При энтеральной иммунизации кроликов путем 6-кратного с 2-дневными интервалами введения холерной муциназы (3 введения в тонкую кишку по 1 мг муциназы и 3 — по 2 мг фермента) в тонкой кишке накапливались IgA-антитела в количестве, равном 1 АФЕ в 0,032 мг белка слизистой оболочки. В этих опытах была обнаружена новая функция антител класса IgA, заключающаяся в способности инактивировать ферменты [Адамов А.К. и др., 1980].
С целью повышения антигенности холерной АТФ-азы в качестве стимуляторов антителогенеза изучались полный адъювант Фрейнда, дрожжевая РНК, вибрионная нейраминидаза и РНК-аза [Майоров Н.В., Адамов А.К., 1985; Майоров Н.В., 1988]. Ни одно из этих веществ не обладало стимулирующим действием на образование анти-АТФ-азных антител при иммунизации кроликов АТФ-азой.
В пробирочных экспериментах антиферментные антитела против холерных ферментов: протеазы, муциназы, нейрами- нидазы, альдолазы, гексокиназы [Адамов А.К. и др., 1977; Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977], АТФ-азы [Адамов А.К., Тихонов Н.Г., 1977], фермента П ФЭП-зависимой глюкозотранспортной системы [Адамов А.К. и др., 1982; Адамов А.К. и др., 1983] замедляли размножение холерных вибрионов; антитела против холерных ферментов протеазы и муциназы [Адамов А.К. и др., 1977] ингибировали размножение холерных вибрионов только в среде с нативным белком. Они также обладали протективной активностью. Сыворотка против АТФ- азы холерного вибриона защищала лигированную петлю тонкой кишки кролика от действия экзотоксина путем подавления его синтеза в клетках вибрионов.
Холерная каталаза вызывала у животных синтез антител, которые, соединяясь с молекулами фермента, не ингибировали их ферментной активности [Адамов А.К. и др., 1977].
Напряженный иммунитет к холере, согласно нашей гипотезе, может быть сформирован с помощью ферментов, выполняющих ключевые функции в транспортных звеньях или метаболических циклах вибрионов и доступных действию антител.
J.P. Loventhal (1956), считая муциназу основным патогенетическим фактором холерных вибрионов, предложил обогащать убитую корпускулярную холерную вакцину препаратом холерной муциназы. Однако J.D.Gillmore и соавт. (1966) не подтвердили данных J.P.Loventhal (1956) о более высокой им- муногенности холерной вакцины, обогащенной муциназой. У кроликов, иммунизированных холерной АТФ-азой [Адамов А.К. и др., 1973; Адамов А.К., 1980], холерной протеазой и ней- раминидазой [Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1981], наблюдалось формирование антибактериальных и антитоксических механизмов защиты. При заражении в лигированные петли тонкой кишки кроликов, иммунизированных перечисленными выше ферментами, отмечались подавление размножения вибрионов в петлях кишки (в 2—7 раз) и снижение индекса наполнения петли кишки на 30—60 % по сравнению с контрольными интактными животными.
В вакцине «холероген-анатоксин + О-антиген» содержатся антигены некоторых ферментов, но в небольшом количестве, и они не вызывают образования антител [Джапаридзе М.Н. и др., 1974].
Холерная нейраминидаза при внутрибрюшинном введении белым мышам вызывала у них существенные изменения в форменных элементах крови [Сазыкин И.С., 1988]. Нейраминидаза в небольшом количестве содержится в вакцине «холероген-анатоксин + О-антиген» [Джапаридзе М.Н. и др., 1978, 1980]. Посредством молекулярного клонирования гена холерной нейраминидазы на кишечной палочке получен штамм — продуцент нейраминидаз [Мишанькин Б.Н. и др., 1989].
Более высокой протективной активностью обладала анти- ферментная сыворотка, содержащая антитела к 3 ферментам холерных вибрионов. У пассивно иммунизированных животных размножение вибрионов в лигированной петле тонкой кишки происходило медленнее в 6 раз и в 3,5 раза была снижена продукция экзотоксина.
По данным Р.В.Fernandes (1979), антитела против НАД- гидролазы внутренней мембраны блокируют АДФ-рибозил- трансферазную активность холерного экзотоксина.
Важность антиферментных механизмов иммунитета была подтверждена R.A.Finkelstein (1986) в экспериментах с белками наружной мембраны холерного вибриона, регулирующими поступление необходимого для размножения вибриона железа путем переноса его с сидерофора в синтетические ферментные звенья вибрионов. R.A.Finkelstein (1986) показал, что иммунные моноклональные антитела против этих белков действуют вибриоцидно на холерные вибрионы и бактериостати- чески на некоторые грамотрицательные бактерии.
Согласно сообщению R.S.Growther и соавт. (1987), ос2-мак- роглобулин ингибирует металлопротеиназу холерного вибриона.
Согласно сообщению D.R.Schneider и G.D.Parker (1978), протеазадефи
Источник: Под ред. В. И. Покровского, «Холера в СССР в период VII пандемии» 2000