МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследование было включено 200 пациентов, находившихся на госпитализации в кардиологическом и терапевтическом отделениях Дорожной клинической больницы. Из них 150 (75%) пациентов ИБС, среди которых 75 (37,5%) больных были с обострением ИБС (нестабильная стенокардия, инфаркт миокарда без зубца Q и с зубцом Q) и 75 (37,5%) - со стабильной стенокардией напряжения. Группу контроля составили 50 (25%) пациентов, считающихся «практически здоровыми» и направленных на профилактическое стационарное обследование работников железнодорожного транспорта по медицинским приказам ОАО «РЖД», без клинически и инструментально подтверждённой ИБС. Средний возраст больных с ИБС, включённых в исследование составлял 63,2 + 9,9 года (в группе контроля 53,2 ± 8,1 года). В исследование не включались пациенты старше 75 лет, больные с острой сердечной недостаточностью, аневризмой аорты, нарушением мозгового кровообращения, онкологической патологией, заболеваниями почек, инсулинзависимым сахарным диабетом, ревматическими заболеваниями, лица страдающие алкоголизмом, пациенты, получавшие медикаментозное лечение гастроэнтерологического профиля в течение последних 12 месяцев перед госпитализацией. Критерием включения в группу контроля являлось так же отсутствие в анамнезе гастроэнтерологической патологии.
Определение функционального класса стабильной стенокардии напряжения осуществлялось по классификации Канадской ассоциации кардиологов согласно национальным рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов [47; 101; 111].
Диагноз нестабильной стенокардии (НС) и инфаркта миокарда (ИМ) устанавливался согласно критериям Нью-йоркской ассоциации кардиологов. Для включения больных с НС необходимым было наличие затяжного приступа стенокардии (более 10 мин) при отсутствии на ЭКГ признаков острого ИМ или утяжеление течения ИБС (возникновение приступов в покое и/или быстрое снижение толерантности к физической нагрузке) в предшествующий месяц в сочетании с изменениями на ЭКГ вне боли (элевация, депрессия сегментов ST и/или инверсия зубцов T в двух и более смежных отведениях). Классы НС определялись по E. Braunwald [202]. Диагноз не-Р-ИМ был подтверждён: приступом боли в грудной клетке, характерным для ишемии миокарда, длительностью 30 мин и более; наличием патологических изменений электрокардиограммы на протяжении не менее 48 часов; повышением уровня ферментов маркеров воспаления (КФК, АсАТ, ЛДГ) в типичные сроки более чем в 2 раза от верхней границы нормы.
При поступлении больного регистрировали следующие анамнестические данные: курение (более 1 года), наличие гастродуоденальной патологии (лечение и диспансерное наблюдение по поводу хронического гастрита и язвенной болезни), артериальной гипертензии (регистрация АД > 140/90 мм.рт.ст.), перенесённого ИМ и нарушений ритма сердца. Регистрировалось лечение, проводимое до поступления больного в стационар - приём аспирина, нитратов, Р- адреноблокаторов, антагонистов кальция, гипотензивных препаратов. Регистрировались показатели ЭКГ в двенадцати стандартных отведениях, на основании которых больные были включены в исследование: продолжительность интервала R-R, депрессия, элевация и девиация сегмента ST (депрессия + элевация) от изоэлектрической линии на 0,1 мВ и более, инверсия зубца Т, наличие патологического зубца Q или комплекса QS.
“Конечными точками” исследования считались тяжёлая повторная стенокардия (возникновение приступов стенокардии в покое продолжительностью более 5 мин, сопровождающейся девиацией сегмента ST более 0,1 мВ или инверсией зубцов Т по крайней мере в двух смежных отведениях ЭКГ); развитие (ре)ИМ, который определяли как затяжной ангинозный приступ (более 30 минут), сопровождавшийся признаками трансмуральной ишемии на ЭКГ и закончившийся формированием электрокардиографических признаков Q-ИМ в виде патологических зубцов Q и/или снижения амплитуды зубцов R в двух смежных отведениях, увеличением уровня КФК в крови более чем в 2 раза от верхней границы нормы; смерть больного.
Всего в исследование включено 150 пациентов ИБС, из них 33 (22%) больных были с инфарктом миокарда, в том числе с наличием зубца Q на ЭКГ - 26 (17,3%) больных. Обследовано 117 (78%) пациентов со стенокардией: 42 (28%) с нестабильной стенокардией и 75 (50%) со стабильной стенокардией
напряжения. В зависимости от течения ИБС были сформированы две группы сравнения - 75 (50%) больных с острым коронарным синдромом (ОКС), включающим инфаркт миокарда и нестабильную стенокардию, и группа больных со стабильной стенокардией напряжения. Количество мужчин и женщин в обследованных группах было примерно равным. Клиническая характеристика обследованных больных ИБС представлена в таблице 1.
Среди больных со стабильной стенокардией напряжение II функциональный класс диагностирован у 55 (73,3%), III функциональный класс - у 20 (26,7%) пациентов. Больные с IV функциональным классом стабильной стенокардии напряжения в исследование не включались. Из числа больных с нестабильной стенокардией по классификации E. Braunwald больных с 1В классом (впервые возникшая или прогрессирующая стенокардия напряжения продолжительностью менее 2 месяцев) было 12 (28,6%), со 11В классом (подострая стенокардия покоя, приступы которой появились в течение предшествующего месяца, но не в последние 48 часов) - 19 (45,2%), с ШВ классом (острая стенокардия покоя, приступы которой появились внезапно в течение последних 48 часов) - 11 пациентов (26,2%).
Таблица 1. - Клиническая характеристика больных ИБС
Примечание', для всех таблиц в скобках указаны проценты. |
Из анамнеза выявлено, что ИБС наиболее часто сочеталась с артериальной гипертензией - у 128 (85,3%) больных и хроническим гастритом - у 86 (57,3%) пациентов. 56 (37,3%) больных ранее перенесли инфаркт миокарда. Из общего числа больных ИБС у 48 (32%) в анамнезе зарегистрирована язвенная болезнь ДПК, у 25 (16,6%) - хронический холецистит, у 8 (5,3%) - хронический панкреатит. Среди больных ИБС 34 (22,6%) страдали ожирением, у 21 (14%) пациента был сопутствующий сахарный диабет 2 типа, средняя продолжительность которого составляла 7,3 года. Курение отмечено у 33 (22%) больных ИБС.
Таблица 2. - Клиническая характеристика больных c острым коронарным синдромом
Примечание'. *в последние сутки перед поступлением в стационар. |
По данным таблицы 2 в группе больных с острым коронарным синдромом, состоящей из 75 человек, пациенты с нестабильной стенокардией составляли 56%, с инфарктом миокарда - 44%, из них с наличием зубца Q на ЭКГ было 26 (78,8%) больных. Преимущественной локализацией инфаркта миокарда являлись передняя 14 (42,4%) и нижняя 12 (36,4%) стенки левого желудочка.
Инфаркт миокарда, артериальная гипертензия и хронические заболевания пищеварительной системы в анамнезе у больных ОКС встречались также часто, как и в общей группе пациентов ИБС. На догоспитальном этапе больным ОКС часто назначались нитраты (34,6%) и Р-адреноблокаторы (28%).
При сравнительном анализе данных анамнеза больных в зависимости от течения ИБС, как видно из таблицы 3, в группе пациентов ОКС было несколько больше мужчин (61,3% > 53,3%) за счёт преобладания их среди больных с инфарктом миокарда - 23 человека, незначительно чаще отмечалось курение (26,6% > 17,3%) и хронический бронхит (14,6% > 9,3%).
Таблица 3. - Сравнительная характеристика анамнестических данных больных в зависимости от течения ИБС
|
Следует отметить, что больные ОКС реже пациентов со стабильным течением ИБС страдали гипертонической болезнью (80% < 90,6%), ожирением (18,8% < 26,6%), сахарным диабетом 2 типа (9,3% < 18,6%) и хроническим панкреатитом (4% < 8%). В анамнезе больных обеих сравниваемых групп одинаково часто встречались хронический гастрит (56% и 58,6%), язвенная болезнь ДПК (30,6% и 33,3%) и хронический холецистит (16% и 17,3%). Следует отметить из анамнестических данных, что средняя продолжительность ИБС в группе больных стабильной стенокардией составляла 9,7 лет и 6,0 лет у больных ОКС, а средняя продолжительность патологии ЖКТ, присутствующей у 82,7% пациентов стабильной ИБС составляла 32,6 года и 30,5 лет у 81,3% больных ОКС. Пациенты обеих сравниваемых групп в зависимости от течения ИБС были сопоставимы по возрасту и не имели достоверных различий по полу.
Таким образом, анализ клинической характеристики обследованных больных позволил выявить наличие связи между ИБС и заболеваниями ЖКТ, особенно гастродуоденальной патологии, которая у 4/5 пациентов являлась фоновой и предшествовала возникновению ИБС, как у мужчин, так и женщин.
Исходя из целей настоящего исследования и поставленных задач у всех пациентов с клинически установленным диагнозом перед выпиской из стационара в соответствии с правовыми аспектами оказания медицинской помощи на основании статей 30-34 и 61 Основ законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан (после подписания добровольного информированного согласия на проведение исследования, составленного на основании Распоряжения директора НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Ярославль ОАО «РЖД» № 23 от 13.10.2010), использовались дополнительные методы обследования больных - эндоскопический, цитологический и гистологический, по результатам которых определялся морфологический тип гастрита; лабораторные методы клинического, биохимического и иммунологического исследований периферической крови.
Диагностика хронического гастрита проводилась по результатам фиброэзо- фагогастродуоденоскопии с визуальной оценкой слизистой оболочки обследуемых отделов желудочно-кишечного тракта, взятием множественных биопсий слизистой оболочки из антрального и фундального отделов желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки в соответствии с требованиями модифицированной Сиднейской системы градации гастрита (1996); цитологическое и гистологическое исследования биопсийного материала с оценкой морфологических изменений по визуально-аналоговой шкале (степень обсеменения H. pylori, нейтрофильной и мононуклеарной инфильтрации, стадии атрофии и кишечной метаплазии), дополненной оценкой наличия/отсутствия гиперплазии эпителия. Оценка по степеням проводилась полуколичественным методом: I степень - отсутствие изучаемых признаков в поле зрения; II степень (слабая) - до 20 объектов в поле зрения; III степень (средняя) - от 20 до 50 в поле зрения; IV степень (сильная) - более 50 в поле зрения [4; 249].
Фиброэзофагогастродуоденоскопия всем пациентам, включённым в исследование выполнялась по назначениям лечащих врачей перед выпиской из стационара панэндоскопом OLYMPUS GIF XQ - 30 (Япония) с биопсийным каналом 2,8 мм после информирования о целях, объёме и возможных осложнениях инвазивного исследования с письменного согласия пациента в соответствии с правовыми аспектами оказания медицинской помощи на основании статей 30-34 и 61 Основ законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан. Фиброэзо- фагогастродуоденоскопия проводилась утром натощак после уточнения отсутствия аллергических проявлений на анестетики под местной анестезией задней стенки глотки и корня языка 10% спреем лидокаина (Egis, Венгрия). Производилась визуальная оценка слизистой пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки с описанием эндоскопической картины по протоколу исследования. Из антрального, фундального отделов желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки по окружности со всех стенок биопсийными щипцами Olympus FB-25K выполнялись биопсии слизистой оболочки. Биоптаты слизистой оболочки направлялись на цитологическое и гистологическое исследование. Для цитологического исследования методом раздавливания биоптата на предметном стекле равномерным слоем готовились мазки-отпечатки, отправляемые на окраску после подсыхания. Для приготовления гистологических препаратов биоптаты фиксировали в 10% растворе формалина и отправляли в патологоанатомическое отделение.
Предметные стёкла с мазками-отпечатками для цитологического исследования окрашивали по методу Романовского-Гимза. Сухие мазки, давностью 3-24 часа фиксировали в метиловом спирте или в смеси Никифорова 5 и 15 минут соответственно. После фиксации погружали в стандартный раствор Гимза (готовой краски Романовского-Гимза) в разведении 1:4 на 30 минут с последующим промыванием дистиллированной водой и высушиванием на воздухе [73].
Приготовление гистологических препаратов проводилось из фиксированных в 10% растворе формалина биоптатов, подвергнутых дегидратации в спиртах восходящей концентрации (70%, 96%, абсолютной) до 24 часов в каждой порции спирта. После обезвоживания фиксированные кусочки на 6-12 часов помещали в хлороформ и затем переносили в расплавленную смесь из равных частей хлороформа с парафином на 2-3 часа в термостат при t 35-40°С. Из смеси хлороформа с парафином кусочки перекладывали в расплавленный в термостате при t° 5455° С парафин. Пропитывание в парафине последовательно в двух порциях 1,0-1,5 часа в первой и 0,5-1,0 час во второй, с последующим быстрым охлаждением и вырезанием блоков с заключёнными в них кусочками. Парафиновые блоки наклеивали на деревянные колодки, которые фиксировали в объектодержателе микротома, производили выравнивание верхней поверхности блока и получение серийных срезов желаемой толщины (5-15 мкм), определяемой установкой микрометрического винта. Расправленный срез помещали на подготовленное прокаленное и смазанное глицерином предметное стекло с экспозицией 6-12 часов перед окраской гематоксилин - эозином. Экспозиция гематоксилина 7-10 минут, промывание водой 3 минуты, экспозиция эозина 1 -2 минуты, после просветления 96% спиртом 0,5 минуты окрашенный препарат покрывали покровным стеклом. Для улучшения диагностики микроорганизмов гистологические препараты дополнительно окрашивали 1% водным раствором метиленового синего - срезы помещали на 5-10 минут в краску, затем выдерживали в 0,25% уксусной кислоте 3-5 секунд, споласкивали водой, проводили через спирты восходящей концентрации и просветляли ксилолом [74].
Просмотр морфологических препаратов осуществляли при увеличении х400 на световом бинокулярном микроскопе МБИ-3 производства «Ленинградского оптико-механического объединения» (Санкт-Петербург).
Лабораторные методы исследования крови.
Кровь для клинического анализа брали у больных из прокола безымянного пальца руки с 8 ч до 9 ч утра натощак не менее чем через 12 часов после последнего приёма пищи перед выпиской из стационара по стандартной методике и сразу после забора отправляли на исследование на гематологическом анализаторе «Sysmex KX-21N» (Roche Diagnostics, Швейцария) с изучением параметров: эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, гемоглобин, гематокрит, эритроцитарные и тромбоцитарные индексы, лимфоциты, нейтрофилы, смешанные клетки (% и количество). Гистограммы распределения эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов. Подсчёт результатов 18 параметров счёта с сообщением о патологических изменениях и отклонениях показателей от нормальных.
Кровь для биохимического исследования брали у больных из кубитальной вены с 8 ч до 9 ч утра натощак не менее чем через 12 часов после последнего приёма пищи перед выпиской из стационара. Пробы крови после забора направлялись в лабораторию, где проводилась подготовка к анализу (сыворотку и плазму отделяли от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после забора крови) и проведение биохимического исследования параметров крови на автоматическом спектрофототрическом анализаторе «Fulli» производства “Biochemical Systems International S.r.l.” (Италия).
Определение ТГ сыворотки крови проводили с использованием набора реагентов для определения концентрации триглицеридов фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя по применению. Использовалась негемолизированная сыворотка или плазма крови. Сыворотку и плазму отде-
ляли от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после забора крови. Пробы перемешивали и инкубировали 10 минут при температуре 37°С. Измерение оптической плотности опытной и калибровочной пробы относительно контрольной пробы при длине волны 550 нм (540-560 нм) в кювете с длиной оптического пути 1 см. Содержание триглицеридов в сыворотке или плазме крови определяли по формуле:
где
С - концентрация триглицеридов в анализируемой пробе, ммоль/л; Апробы - оптическая плотность анализируемой пробы, ед. опт. пл.; Акалибратора - оптическая плотность калибратора, ед. опт. пл;
2,25 - содержание глицерина в калибраторе, ммоль/л.
При содержании триглицеридов в сыворотке или плазме крови выше 11,3 ммоль/л пробу разводили физиологическим раствором и полученный результат умножали на разведение.
Определение ХС сыворотки крови проводили с использованием набора реагентов для определения концентрации холестерина фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Использовалась негемолизированная сыворотка или плазма крови. Сыворотку и плазму отделяли от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после забора крови. Пробы перемешивали и инкубировали 10 минут при температуре 37 С. Измерение оптической плотности опытной и калибровочной пробы относительно контрольной пробы при длине волны 510 нм (500-546 нм) в кювете с длиной оптического пути 1 см. Содержание холестерина в сыворотке или плазме крови определяли по формуле:
где
С - концентрация холестерина в анализируемой пробе, ммоль/л; Апробы - оптическая плотность анализируемой пробы, ед. опт. пл.; Акалибратора - оптическая плотность калибратора, ед. опт. пл;
5,2 - содержание холестерина в калибраторе, ммоль/л.
При содержании холестерина в сыворотке или плазме крови выше 18,1 ммоль/л пробу разводили физиологическим раствором и полученный результат умножали на разведение.
Уровень ХС ЛПНП определяли с помощью диагностического набора LDL- CHOLESTEROL Direct liquid reagent - Холестерин ЛПНП прямой (жидкий реагент) фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Условия измерения: длина волны 630 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Измерить оптическую плотность стандарта и пробы против реагентного бланка. Расчёт ЛПНП в сыворотке или плазме крови определяли по формуле:
—
А стандарт
Метод линеен до 400 мг/дл. При более высокой концентрации пробу следует развести физиологическим раствором 1+9 и результат умножить на 10. Детекцион- ный предел составляет 1 мг/дл.
Уровень ХС ЛПВП определяли с помощью диагностического набора HDL- CHOLESTEROL Direct liquid reagent - Холестерин ЛПНП прямой (жидкий реагент) фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Сыворотку крови перемешивали и инкубировали 5 минут при температуре 37 С. Условия измерения: длина волны 630 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см с измерением оптической плотности стандарта и пробы против реагентного бланка.
Расчёт ЛПНП в сыворотке крови определяли по формуле:
А стандарт
Метод линеен до 220 мг/дл. При более высокой концентрации пробу следует развести физиологическим раствором 1+9 и результат умножить на 10. Детекцион- ный предел составляет 1 мг/дл.
Для оценки соотношения атерогенных и антиатерогенных липопротеинов рассчитывали холестериновый коэффициент атерогенности по формуле [86]: КА (ед) = (ХС - ХС ЛПВП) : ХС ЛПВП.
Активность АлАТ определяли с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Набор обеспечивает линейную область определения активности аланинами- нотрансферазы в диапазоне от 10 до 440 Ед/л, отклонение от линейности не превышает 5%. Чувствительность не более 5 Ед/л, коэффициент вариации результатов определения - не более 5%. Для образца использовалась сыворотка крови без гемолиза не позднее, чем через 1 час после забора крови. Условия измерения: длина волны 340 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Измерить оптическую плотность 3 раза с интервалом в 1 минуту и рассчитать изменение оптической плотности за 1 минуту (дОП/мин). Активность аланинаминотрансферазы определяли по формуле:
A = дОП/мин х 1746, где
А - активность аланинаминотрансферазы, Ед/л;
ДОП/мин - изменение оптической плотности пробы за 1 минуту, ед. опт. пл.;
1746 - фактор пересчёта для выражения активности аланинаминотрансферазы в Ед/л (указывается в паспорте на набор).
Примечание: 1Ед/л х 0,0167 = мкКат/л
Если ДОП/мин более или равно 0,200 образец следует развести физиологическим раствором 1+9 и результат умножить на 10.
Активность АсАТ определяли с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Набор обеспечивает линейную область определения активности аспартатами- нотрансферазы в диапазоне от 10 до 440 Ед/л, отклонение от линейности не превышает 5%. Чувствительность не более 5 Ед/л, коэффициент вариации результатов определения - не более 5%. Для образца использовалась сыворотка крови без гемолиза не позднее, чем через 1 час после забора крови. Условия измерения:
длина волны 340 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Измерить оптическую плотность 3 раза с интервалом в 1 минуту и рассчитать изменение оптической плотности за 1 минуту (дОП/мин). Активность аспартатаминотрансферазы определяли по формуле:
A = дОП/мин х 1769, где
А - активность аспартатаминотрансферазы, Ед/л;
ДОП/мин - изменение оптической плотности пробы за 1 минуту, ед. опт. пл.;
1769 - фактор пересчёта для выражения активности аспартатаминотрансферазы в Ед/л (указывается в паспорте на набор).
Примечание: 1Ед/л х 0,0167 = мкКат/л
Если ДОП/мин более или равно 0,200 образец следует развести физиологическим раствором 1+9 и результат умножить на 10.
Определение креатинина сыворотки крови проводили с использованием набора реагентов для определения концентрации креатинина фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Набор обеспечивает линейную область определения концентрации креатинина в диапазоне от 30 до 2212 мкмоль/л, отклонение от линейности не превышает 5%. Чувствительность не более 25 мкмоль/л, коэффициент вариации результатов определения - не более 5%. Использовалась сыворотка крови без гемолиза. Условия измерения: длина волны 505 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Пробы перемешивали и через 30 секунд преинкубации измеряли оптическую плотность А1 и через 60 секунд (время реакции) измеряли оптическую плотность А2. Рассчитывалась дельта оптической плотности ДА = А2 - А1.
Содержание креатинина в сыворотке крови определяли по формуле:
где
С - концентрация креатинина в анализируемой пробе, мкмоль/л; ДАпробы - оптическая плотность анализируемой пробы, ед. опт. пл.; ДАкалибратора - оптическая плотность калибратора, ед. опт. пл;
177 - содержание креатинина в калибраторе, мкмоль/л.
При содержании креатинина в сыворотке крови выше 2212 мкмоль/л анализируемую пробу разводили физиологическим раствором и полученный результат умножали на разведение.
Определение мочевины сыворотки крови проводили с использованием набора реагентов для определения концентрации мочевины фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Набор обеспечивает линейную область определения концентрации мочевины в диапазоне от 2 до 50 ммоль/л, отклонение от линейности не превышает 5%. Чувствительность не более 1 ммоль/л, коэффициент вариации результатов определения - не более 3%. Использовалась негемолизированная сыворотка крови не позднее, чем через 1 час после забора крови. Условия измерения: длина волны 340 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Пробы перемешивали и через 30 секунд преинкубации измеряли оптическую плотность А1 и через 60 секунд (время реакции) измеряли оптическую плотность А2. Рассчитывалась дельта оптической плотности ДА = А2 - А1.
Содержание мочевины в сыворотке крови определяли по формуле:
С =
ДА калибратора
где
С - концентрация мочевины в анализируемой пробе, ммоль/л;
ДАпробы - оптическая плотность анализируемой пробы, ед. опт. пл.;
ДАкалибратора - оптическая плотность калибратора, ед. опт. пл;
8,325 - содержание мочевины в калибраторе, ммоль/л.
При содержании мочевины в сыворотке крови выше 50 ммоль/л анализируемую пробу разводили физиологическим раствором и полученный результат умножали на разведение.
Иммунологическое исследование крови.
Кровь для иммунологического исследования брали у больных из кубитальной вены с 8 ч до 9 ч утра натощак не менее чем через 12 часов после последнего приёма пищи перед выпиской из стационара. Для исследования использовалась сыворотка крови без гемолиза после отделения от форменных элементов крови не
позднее, чем через 1 час после забора крови. Определение иммунологических показателей проводилось на автоматическом иммуноферментном анализаторе «TRITURUS» (Diagnostic Grifols S.A. Испания).
Определение титра IgG антител к Helicobacter pylori проводилось методом твёрдофазного иммуноферментного анализа набором «ImmunoComb® II Helicobacter pylori IgG» (“Orgenics LTD”, Израиль). В набор входит положительный контроль (анти-Я. pylori IgG) и отрицательный контроль, которые должны использоваться при анализе каждой группы образцов. По завершению анализа, на зубце с положительным контролем должны быть две серо-голубые точки. На зубце с отрицательным контролем должна появиться верхняя точка, а нижней точки либо вовсе не должно быть, либо она должна быть слабой. Верхняя точка также должна появиться на всех остальных зубцах, подтверждая, что образец был добавлен. Анализировалась центрифугированная надосадочная жидкость сыворотки, либо плазмы крови. Уровень анти-Я. pylori IgG в каждом из образцов оценивался, сравнивая интенсивность окраски нижней точки каждого зубца с цветовой шкалой CombScale, входящей в состав набора. Величины равные, либо большие 20 U/ml указывают на инфицирование Я. pylori.
Количественное определение уровня С-реактивного белка сыворотки крови проводили с использованием набора реагентов «CRP Latex L» фирмы «Hospitex Diagnostics» (Италия) согласно инструкции производителя. Использовалась свежая сыворотка без гемолиза комнатной температуры. Условия измерения: длина волны 546 ± 20 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.
Расчёт определяли по формуле:
2 ~ А1 2 - А1
Метод линеен до концентрации 150 мг/л. Образцы с более высокой концентрацией необходимо развести физиологическим раствором в 1/5 и повторить измерение, полученный результат умножить на 5. Детекционный предел: 1 мг/л.
Количественное определение гомоцистеина проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Axis-Shield» (Норвегия) согласно инструк
ции производителя. Данная тест-система предназначена для определения гомоцистеина в сыворотке или плазме крови методом иммуноферментного анализа. Свежесобранные образцы плазмы или сыворотки должны быть центрифугированы сразу после забора крови. В проведённом исследовании была использована ЭД- ТА-плазма или сыворотка крови по предписанной методике производителя. Образец цельной крови должен быть оставлен для образования сгустка не более чем на 30 минут при комнатной температуре. У образцов крови после формирования сгустка отделяли сыворотку или хранили этот образец на льду до отделения сыворотки. ЭДТА-образцы центрифугируются или помещаются на лёд немедленно после получения. Образцы плазмы могут храниться на льду до 6 часов после центрифугирования и отделения. Перед началом анализа все реагенты должны достичь комнатной температуры (18-26°С). Считывание оптической плотности ячеек проводилось при 450 нм в течение 15 минут с использованием автоматического встряхивания. Референс-значения гомоцистеина были установлены с доверительным интервалом 95% - 5-15 мкмоль/л, калибраторы имеют концентрацию в диапазоне от 2,0 до 50,0 мкмоль/л. Чувствительность была определена с использованием разведенных SAH-калибраторов с концентрациями от 4,0 до 0,5 мкмоль/л. Полученная чувствительность данного метода - 1,0 мкмоль/л с CV (коэффициентом вариации) < 20%.
Количественное определение sP-селектина проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия) согласно инструкции производителя. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрации sP-селектина, присутствующего в образцах. Концентрация sP-селектина в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по приготовленным разведениям стандарта sP-селектина. Для анализа используется сыворотка или плазма крови. Отделение сыворотки от сгустка эритроцитов проводится сразу после свёртывания крови. Субстратный раствор должен иметь комнатную температуру перед использованием. Определение оптической плотности ячеек при 450 нм против «Бланка», желательно использовать длину волны сравнения 620 нм (допустима длина волны сравнения в диапазоне 610-650 нм) с расчётом среднего значения поглощения для каждого стандарта и образца.
Количественное определение молекулы сосудистой адгезии (sVCAM-1) проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия) согласно инструкции производителя. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрации sVCAM-1, присутствующего в образцах. Концентрация sVCAM-1 в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по 5 разведениям стандарта sVCAM-1. Для исследования использовалась сыворотка крови, отделённая от сгустков эритроцитов сразу после свёртывания крови. Субстратный раствор должен иметь комнатную температуру перед использованием. Определение оптической плотности ячеек при 450 нм против «Бланка», желательно использовать длину волны сравнения 610-650 нм с расчётом среднего значения поглощения для каждого стандарта и образца. Минимально определяемая концентрация sVCAM-1, измеренная как среднее плюс 3 стандартных отклонения 6-кратно измеренного образца 0 нг/мл (разводящий раствор) составляет 0,6 нг/мл.
Количественное определение молекулы межклеточной адгезии (sICAM-1) проводилось с помощью диагностического набора реагентов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия) согласно инструкции производителя. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрации sICAM-1, присутствующего в образцах. Концентрация sICAM-1 в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по 5 разведениям стандарта sICAM-1. Для исследования использовалась сыворотка крови, отделённая от сгустков эритроцитов сразу после свёртывания крови. Субстратный раствор должен иметь комнатную температуру перед использованием. Определение оптической плотности ячеек при 450 нм против «Бланка», желательно использовать длину волны сравнения 610-650 нм с расчётом среднего значения поглощения для каждого стандарта и образца. Минимально определяемая концентрация sICAM-1, из-
А так же в разделе «МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ »
- ВВЕДЕНИЕ
- АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- СТЕПЕНЬ РАЗРАБОТАННОСТИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ . ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
- НАУЧНАЯ НОВИЗНА
- ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
- ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
- СТЕПЕНЬ ДОСТОВЕРНОСТИ И АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
- 1.1. Характеристика данных фиброэзофагогастродуоденоскопии больных контрольной группы.