Принцип метода: Содержание токоферола в крови оценивают по степени гемолиза эритроцитов в кислой среде, интенсивность которого пропорциональна недостаточности витамина Е.
Реактивы.

1. 1 М раствор соляной кислоты (НС1).
2. Фосфатный буфер, рН 7,4: 14,2 г безводного гидрофосфата натрия (№2НР04) или 17,8 г кристаллогидрата натрия (№2НРО4-2Н2О) переносят в мерную колбу на 1 л, растворяют в 100-200 мл дистиллированной воды, добавляют 20 мл 1 М раствора соляной кислоты и доводят дистиллированной водой до метки. Тщательно перемешивают.
3. Физиологический раствор (0,9 % раствор №С1).
   
4. Рабочий реактив: готовят в день исследования из равных объемов фосфатного буфера с рН 7,4 и физиологического раствора.
5. 0,1% раствор диалуровой (5-гидроксибарбитуровой) кислоты (С4Н4О4К2): 10 мг диалуровой кислоты растворяют в небольшом количестве рабочего реактива и доводят объем до 100 мл.

Исследования проводят на спектрофотометре.
Ход определения.

1. В центрифужную пробирку наливают 5 мл рабочего реактива и вносят туда 20-30 мкл (0,02-0,03 мл) цельной крови, осторожно перемешивают содержимое.
2. Центрифугируют пробу при 2000 об/мин в течение 10 мин.
3. Верхний слой центрифугата сливают.
4. Готовят взвесь эритроцитов, добавляя к осадку 5 мл рабочего реактива, перемешивают, избегая резкого встряхивания пробы.
5. В 3 чистые центрифужные пробирки наливают по 1 мл взвеси эритроцитов (номера проб 1, 2, 3), при этом желательно обрабатывать параллельные пробы.
6. В пробы № 1 и № 2 приливают по 1 мл диалуровой кислоты, в пробу № 3-1 мл смешанного реактива. Пробирки закрывают стеклянными пробками и ставят в термостат при 370 С на 60 мин.
7. Пробы вынимают из термостата и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 60 мин.
8. К пробам № 1 и № 2 приливают по 5 мл рабочего реактива, к пробе № 3

• 5 мл дистиллированной воды. Пробы осторожно перемешивают плавным покачиванием.

9. Центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин.
10. Надосадочную жидкость переносят в спектрофотометрические кюветы.
11. Фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 415 нм, установив прибор на 100% пропускание (Т), в качестве контроля используют рабочий реактив.
12. Показания пропускания переводят в величины оптической плотности.

Расчет проводят по формуле:
Е1 -Е3
X =              х 100%; где
Е2 - Е3
X - процент гемолиза эритроцитов, %;
Е1 - оптическая плотность пробы 1;
Е2 - оптическая плотность пробы 2;
Е3 - оптическая плотность пробы 3.
Норма: при нормальной обеспеченности организма токоферолом
процент гемолиза эритроцитов колеблется в пределах 5-10 % и менее (содержание токоферола более 960 мкг/дл).
Принцип метода: Методика основана на способности специальных штаммов бактерий развиваться только в присутствии витамина В12 и изменять рН культуральпой среды. Определение витамина В12 производят методом сравнения исследуемой жидкости с серией стандартных разведений витамина В12 различных концентраций.
Реактивы.

1. Культура-мутант кишечной палочки E.coli 113-3. Взвесь суточной культуры кишечной палочки разводят в физиологическом растворе до достижения количества 50 млн/мл.
2. Твердая синтетическая среда для культуры кишечной палочки: казеиновый кислотный или ферментативный гидролизат (в пересчете на сухое вещество) - 0,6 г; гидрофосфат калия (К2НРО4) - 20 мг; сульфат железа

• 0,5 мг; сульфат магния - 20 мг; аспарагин - 20 мг; глицерин - 200 мг; агар-агар - 1,5 г; витамин В12 - 10 мг. Все компоненты вносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Среду стерилизуют в течение 15 мин при атмосферном давлении.

3. Пептоново-солевой агар: 20 г пептона, 5 г хлорида натрия, 20 г агар- агара растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 л и доводят объем до метки, устанавливают рН 7,0.
4. Физиологический раствор (0,9 % раствор хлорида натрия).
5. Питательная среда: хлорид аммония - 4,0 г; гидрофосфат калия (К2НРО4) - 0,8 г; хлорид натрия (NaCl) - 6,0 г, цитрат натрия - 6,0 г; лактоза - 6,0 г. Все компоненты переносят в мерную колбу на 1 л и доводят до метки дистиллированной водой.
6. Ацетатный буфер, рН 4,5: в мерную колбу на 1 л наливают 300-400 мл дистиллированной воды, вносят 26,8 г ацетата натрия, приливают 14,25 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки.
7. 2% раствор гидроксида натрия (№ОН).
8. 0,2 М раствор гидроксида натрия (№ОН).
9. 2,5% раствор нитрита натрия (NaN02).
10. 2,5% спиртовой раствор индикатора бромтимолового синего, рН 7,0.
11. Стандартный раствор витамина В12.

Специальное оборудование: автоклав, термостат, пробирки Кана.
Ход определения.

1. Накануне опыта производят пересев культуры на пептоново-солевой агар.
2. Для разрушения белково-витаминного комплекса с выделением витамина В12 2 мл сыворотки крови наливают в химическую пробирку, куда добавляют 2 мл ацетатного буфера, 1,9 мл дистиллированной воды и 0,1

мл 2,5% раствора нитрита натрия (рН 4,5). После перемешивания проводят автоклавирование в течение 20 мин при 0,5 атм. Пробу охлаждают и центрифугируют. Прозрачный центрифугат переносят в чистую пробирку, отбирают 1 мл (контроль), рН оставшегося объема центрифу- гата доводят до 6,8-7,0, используя 2% раствор гидроксида натрия (№ОН).

3. 1 мл контрольной пробы смешивают с равным объемом 0,2 М раствора гидроксида натрия (№ОН) и кипятят на бане с обратным холодильником в течение 30 мин. После охлаждения рН раствора доводят до 6,8

7,0.

4. Готовят три ряда стерильных пробирок Кана по 10-12 шт. в каждом. В пробирки наливают по 0,5 мл питательной смеси. В первую пробирку каждого ряда наливают по 0,5 мл соответственно опыта, стандарта и контроля. Тщательно перемешивают и отбирают по 0,5 мл жидкости из первых пробирок и переносит во вторые, затем в третьи и т.д., перемешивая после добавления каждой порции. Во все пробирки добавляют по 1 капле культуры, что соответствует приблизительно 2,5 млн микробных тел. Все пробирки термостатируют при температуре 370 С в течение 24 часов.
5. Через сутки в каждую пробирку добавляют по 1 капле индикатора бромтимолового синего. При отсутствии витамина В12 в среде сохраняется зеленая окраска. В пробирках, где присутствует витамин В12, происходит развитие кишечной палочки и зеленый цвет изменяется на желтый. Зная чувствительность культуры (по стандартному ряду) и степень разведения исследуемой жидкости, по последней пробирке, в которой изменилась окраска среды, можно вычислить содержание витамина В12 в сыворотке крови.

Расчет содержания витамина В12 проводят по формуле:
Х= а*№Р, где
X - содержание витамина В12 в исследуемой сыворотке крови, нг/мл;
а - минимальная концентрация витамина, нг/мл;
N - номер пробирки, соответствующий пробе, в которой еще наблюдается
рост культуры;
Р - разведение исследуемой пробы, которое находят по шкале (см. табл.
20).
Таблица 20
Шкала для расчета содержания витамина В12

Содержание витамина В12 в стандартном ряде, нг/мл	Пробирки в ряде
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	50	25	12,5	6,25	3,125	1,563	Роста нет
Разведение исследуемой жидкости	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024

Например: Рост кишечной палочки в стандартном ряду наблюдается при минимальной концентрации 3,125 нг/мл, а в опытном ряду - в 5-й пробирке. Следовательно, с учетом 3-кратного разведения сыворотки при ее обработке концентрация витамина В12 будет равна 300 нг/мл (3,125*32*3).
Норма. У здоровых людей содержание витамина В12 в сыворотке крови колеблется в пределах 0,074-0,52 нмоль/л (100-700 нг/мл).