Принцип метода. Методика основана на реакции восстановления

6. дихлорфенолиндофенола в кислой среде в присутствии аскорбиновой кислоты в лейкоформу. При этом аскорбиновая кислота окисляется в ди- гидроаскорбиновую. О завершении окислительно-восстановительного процесса свидетельствует появление розового окрашивания титруемого раствора после добавления очередной капли 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Реактивы:

1. 1/15 М раствор дигидрофосфата калия (КН2РО4): 9,078 г КН2РО4 растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
2. 1/15 М раствор гидрофосфата натрия (Ш^ОТО^: 11,876 г кристаллогидрата Na2HP04x2H20 растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
3. 0,1 н. раствор серной кислоты (И^О4).
4. 2 М раствор соляной кислоты.
5. Насыщенный раствор оксалата аммония: 10 г сухого реактива заливают 100 мл дистиллированной воды при комнатной температуре, перемешивают до растворения.
6. 50% раствор серной кислоты (И^О4): концентрированную серную кислоту (относительная плотность 1,84) разводят дистиллированной водой в соотношении 1:2.
7. 0,01 н. раствор оксалата натрия (Na2C^4) для проверки титра 0,01 н. раствора перманганата калия (КМпО4). Ввиду того, что соль гигроскопична, ее необходимо поместить на несколько часов в эксикатор с концентрированной серной кислотой, бюкс или чашечку с реактивом оставляют открытой. Для приготовления 0,1 н. раствора берут не менее

2. 3 навесок. Используют свежеприготовленный раствор. Навески в количестве 67 мг переносят в мерные колбы на 100 мл, растворяют в би- дистиллированной воде, доводят объем до метки, перемешивают.

8. 0,01 н. раствор перманганата калия (КМпО4): готовят из фиксанала или берут навеску в количестве 316 мг, которую растворяют в мерной колбе на 1 л сначала в небольшом количестве дистиллированной воды (200300 мл), а затем доводят объем до метки и тщательно перемешивают. До проверки титра реактив необходимо выдержать 10-14 дней, поскольку в свежеприготовленном растворе титр неустойчив.
9. 0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (краска Тильманса). Готовят более концентрированный раствор краски Тильманса, так как реактив неустойчив при хранении: 0,3 г 2,6-дихлорфенолиндофенола растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды, энергично взбалты
   вают и оставляют на несколько часов или до следующего дня для лучшего растворения. В целях удлинения срока хранения к краске Тиль- манса прибавляют 120 мл 1/15 М раствора дигидрофосфата калия (КН2РО4) и 180 мл 1/15 М раствора гидрофосфата натрия (Ка2ИРО4), перемешивают и доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Тщательно перемешивают и фильтруют. Приготовленную таким образом краску Тильманса можно хранить в течение 12-14 дней в посуде из темного стекла на холоде. В дни проведения исследований титр 2,6- дихлорфенолиндофенола обязательно уточняют по 0,01 н. раствору соли Мора.

10.0,01 н. раствор соли Мора: навеску сухой соли Мора - 392 мг - переносят в мерную колбу на 100 мл и добавляют 5 мл 0,1 н. раствора серной кислоты, растворяют и доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Хранят в посуде из темного стекла на холоде.
Проверка титров реактивов:

1. 0,01 н. раствор перманганата калия (КМпО4): в колбу на 50 мл вносят 10 мл 0,01 н. раствора оксалата натрия и 2,5 мл 50% раствора серной кислоты, перемешивают и нагревают на водяной бане почти до кипения. Затем титруют 0,01 н. раствором перманганата калия до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 30 сек. Коэффициент поправки для 0,01 н. раствора перманганата калия рассчитывают по формуле:

тг              а
К =              , где

• х 0,067

а - навеска оксалата натрия, г;

• - объем 0,01 н. раствора перманганата калия, израсходованного на титрование, мл;

0. 067 - количество раствора оксалата натрия (№2СаО4), соответствующее 1 мл 0,01 н. раствора перманганата калия (КМпО4), мл.

2. 0,01 н. раствор соли Мора: в колбу на 50 мл отбирают 10 мл раствора соли Мора, доливают 1,5 мл 50% раствора серной кислоты (И2БО4), перемешивают и титруют 0,01 н. раствором перманганата калия (КМпО4) до стойкого слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Поправку к титру соли Мора (K1) рассчитывают по формуле:

тл V х К К1 =              , где
10

• - объем 0,01 н. раствора перманганата калия, пошедшего на титрование, мл;

10 - объем соли Мора, мл;
К - коэффициент поправки для 0,01 н. раствора перманганата калия (КМпО4).

3. Краска Тильманса: в пробирку Хагедорна отбирают 10 мл 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, добавляют 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония и титруют 0,01 н. раствором соли Мора до изменения синей окраски на соломенно-желтую (нерезкая перемена окраски указывает на непригодность краски Тильманса). Коэффициент поправки для краски Тильманса рассчитывают по формуле:

К2= V х K1, где

• - объем раствора соли Мора, пошедшего на титрование, мл;

K1 - коэффициент поправки к титру соли Мора.
Ход определения.

1. В пробирку Хагедорна отбирают 5 мл мочи, приливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и подкисляют мочу 2% раствором соляной кислоты.
2. Титруют 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Титровать рекомендуется при дневном освещении, используя белый фон. Для того чтобы точнее уловить момент окончания титрования, ставят параллельные пробы для сравнения окраски.

Расчет содержания аскорбиновой кислоты в суточном объеме мочи ведут по формуле:
Tjr К 2 X а x 0,088 xV Х =              ^              , где
Х - содержание аскорбиновой кислоты, мг;
а - количество 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование 5 мл мочи, мл;
К2 - коэффициент поправки к титру краски Тильманса;

0. 088 - количество аскорбиновой кислоты, восстанавливающее 1 мл краски Тильманса, мг;

• - суточный объем мочи, мл;

5 - объем мочи, взятой для исследования, мл.
В норме суточная экскреция аскорбиновой кислоты у практически здоровых людей составляет 30-40 мг/сут, или 0,11-0,22 ммоль/сут.

2. Определение аскорбиновой кислоты в сыворотке крови по

Тильмансу
Принцип метода. Методика основана на реакции восстановления

6. дихлорфенолиндофенола в кислой среде в присутствии аскорбиновой кислоты в лейкоформу. При этом аскорбиновая кислота окисляется в ди- гидроаскорбиновую. О завершении окислительно-восстановительного процесса свидетельствует появление розового окрашивания титруемого
   раствора после прибавления очередной капли 2,6-дихлорфенолиндо- фенола.

Реактивы:
Те же, что и для определения аскорбиновой кислоты в моче и дополнительно:

1. 0,0005 н. раствор краски Тильманса: готовят из 0,001 н. раствора 2,6- дихлорфенолиндофенола разведением дистиллированной водой в соотношении 1:1.
2. 20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

Ход определения.
Берут 1 мл сыворотки крови и медленно приливают 2,5 мл 20% раствора ТХУ, встряхивая пробу, добавляют 2,5 мл дистиллированной воды, смешивают. Белки крови при этом осаждаются. Через 30 мин центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку Хагедорна и титруют 0,0005 н. раствором 2,6- дихлорфенолиндофенола до слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 30 с.
Расчет содержания аскорбиновой кислоты в сыворотке крови ведут по формуле:
„ К х а х 0,088 х100
Х =                                          , где
2
Х - содержание аскорбиновой кислоты, мг/дл;
а - количество 0,0005 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование 1 мл сыворотки крови, мл;
К - коэффициент поправки к титру краски Тильманса;

0. 088              - количество аскорбиновой кислоты, восстанавливающее 1 мл краски Тильманса, мг;

2 - разведение краски Тильманса;
100 - расчет на 100 мл сыворотки крови.
Коэффициент для перевода концентрации аскорбиновой кислоты в сыворотке крови из мг/дл в мкмоль/л - 5,678.
В норме содержание аскорбиной кислоты в крови составляет 40-114 мкмоль/л, или 0,7-2,0 мг/дл; в плазме - 40-70 мкмоль/л, или 0,7-1,2 мг/дл.

3. Определение тиамина (витамина В1) в моче по Вангу и Харрису

Принцип метода: Определение тиамина основано на его окислении в тиохром красной кровяной солью в щелочной среде с последующим извлечением тиохрома изобутиловым спиртом и измерением флюоресценции.
Реактивы:

1. 20% раствор гидроксида натрия (NaOH).
   
2. 10% раствор красной кровяной соли [K3Fe(CN)6] квалификации х.ч. или

ч.д.а. Раствор готовят непосредственно перед исследованием.

3. 96% этиловый спирт.
4. Спирт изобутиловый или изоамиловый. Все спирты, используемые в методике, должны быть очищены от флюоресцирующих примесей перегонкой или обработкой активированным углем (температура кипения изобутилового спирта 108°С, изоамилового - 123-130°С).
5. 0,1 М раствор соляной кислоты (НС1).
6. Основной стандартный раствор витамина В1 с содержанием тиамина 100 мкг/мл: 10 мг тиамина вносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем до метки. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла, пригоден в течение 4-6 мес.
7. Рабочие стандартные растворы с содержанием тиамина 1-5 мкг/мл: готовят в день проведения исследования из основного стандартного раствора соответствующим разведением 0,1 М раствором соляной кислоты. Например, для получения рабочего раствора с содержанием тиамина 2 мкг/мл в мерную колбу на 100 мл вносят 2 мл основного стандартного раствора (абсолютное содержание тиамина - 200 мкг) и доводят объем до метки 0,1 М раствором соляной кислоты, тщательно перемешивают. Рабочий стандартный раствор пригоден для использования в течение 4

5. дней. Хранят в холодильнике.

Определение содержания тиамина осуществляют на флюориметре.
Ход определения.
В пробирки с пришлифованными пробками вносят по 5 мл мочи, такой же объем изобутилового или изоамилового спирта и встряхивают интенсивно в течение 2 мин. Моча при этом очищается от посторонних флюоресцирующих примесей.
После расслоения верхний спиртовой слой удаляют отсасыванием с помощью водоструйного насоса.
В две пробирки со стеклянными притертыми пробками вносят по 1 мл очищенной мочи. Одна из них будет служить контролем (К) на наличие в моче не удаленных флюоресцирующих примесей, другая опытом (О) для определения концентрации тиамина в моче.
В пробирку с обозначением “К” вносят 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и встряхивают.
В пробирку с обозначением “О” вносят 1 мл 20% раствора гидроксида натрия, встряхивают и немедленно по каплям при постоянном перемешивании добавляют свежеприготовленный 10% раствор красной кровяной соли до появления желтоватой окраски, не исчезающей в течение 30 с, что обусловлено окислением тиамина в тиохром.
Параллельно с серией опытов готовят серию стандартных проб (Ст), в которые вносят по 1 мл стандартных растворов с содержанием тиамина

1. 5 мкг/мл, добавляют по 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и по каплям до появления желтой окраски - 10% раствор красной кровяной соли.

Для того чтобы учесть наличие посторонний флюоресцирующих примесей в реактивах, необходимо поставить контрольную пробу к стандартному раствору (Кст). Для этого берут 1 мл дистиллированной воды, прибавляют 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 10% раствора красной кровяной соли.
Во все пробирки с обозначениями “О”, “К”, “Ст” и “Кст” добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и приливают по 7 мл изо- бутилового или изоамилового спирта энергично встряхивают в течение 2 мин (одновременно проводят обработку нескольких пробирок). Ставят в темное место для расслоения.
После расслоения отсасывают по 5 мл верхнего спиртового слоя с извлеченным тиохромом в химические пробирки, в которые предварительно наливают по 1 мл этилового спирта для просветления, раствора и смешивают. Отсасывание следует начинать с контрольных пробирок используя предназначенную для этого пипетку.
Интенсивность флюоресценции измеряют на флюориметре. Флюориметр настраивают по стандартному раствору, наиболее близко совпадающему по показаниям с исследуемой мочой. Как правило, берут стандарт концентрацией 2 мкг/мл и 4 мкг/мл и устанавливают соответственно на 40 и 80 делений.
Измеряют флюоресценцию опытных, стандартных и контрольных
проб.
Расчет содержания тиамина в суточном количестве мочи проводят по формуле:
„ С х (О - К) xV
X = —-              -—, где
а - Кст
X - содержание тиамина в моче, мкг/сут;
С - концентрация тиамина в стандартном растворе, нмоль/мл (мкг/мл);
О              - показание флюориметра для опытной пробы мочи;
К - показание флюориметра для контрольной пробы мочи; а - показание флюориметра для стандартного раствора;
Кст - показание флюориметра для контрольной пробы на реактивы;

• - суточный объем мочи, мл.

Коэффициент для перевода содержания тиамина в моче из мкг/сут в нмоль/сут составляет 2,965.
В норме суточное содержание витамина В1 в моче составляет 4441480 нмоль (150-500 мкг); часовое натощак - 44,5-88,9 нмоль (15-30 мкг).
Содержание свободного тиамина в плазме крови - 30-45 нмоль/л (11,5 мкг/дл).