Принцип метода. Методика определения 4-пиридоксиловой кислоты основана на ее превращении в результате гидролиза в лактонную фор
му, максимум флюоресценции которой проявляется в щелочной среде при рН 9,0-10,0.
Реактивы.

1. Синтетический лактон 4-пиридоксиловой кислоты.
2. 0,6 М раствор соляной кислоты: концентрированную кислоту с относительной плотностью 1,26 разводят дистиллированной водой в соотношении 1:10.
3. 0,1 М раствор соляной кислоты.
4. Тетраборат натрия (бура кристаллическая, Na4B4О7 * 10 Н2О), х.ч.
5. Индикатор универсальный.
6. Приготовление основного стандартного раствора: 4 мг кристаллического лактона 4-пиридоксиловой кислоты вносят в мерную колбу на 100 мл и растворяют в небольшом объеме 0,1 М раствора соляной кислоты, доводят объем до метки 0,1 М раствором соляной кислоты. В 1 мл основного стандартного раствора содержится 40 мкг лактона 4- пиридоксиловой кислоты. Раствор хранят в холодильнике в запарафи- нированной посуде из темного стекла, пригоден для работы в течение 5

6. мес.

7. Рабочий стандартный раствор готовят из основного: в мерную колбу на 100 мл микропипеткой отмеривают 0,2 мл основного стандартного раствора, туда же приливают в небольшом количестве (приблизительно 10 мл) 0,1 М раствор соляной кислоты, объем доводят дистиллированной водой до метки. В 1 мл рабочего стандартного раствора содержится

0. 008 мг лактона 4-пиридоксиловой кислоты. Рабочий стандартный раствор готовят в день выполнения исследования, при хранении в холодильнике пригоден в течение 4-5 дней.

8. Готовят стандарты с содержанием 0,04 и 0,08 мкг лактона, для чего берут соответственно 5 и 10 мл рабочего стандартного раствора, вливают в две фарфоровые чашечки. В первую, куда добавлено 5 мл рабочего стандартного раствора, приливают 5 мл дистиллированной воды (доводят объем до 10 мл). Применяя кристаллическую буру, которую добавляют небольшими порциями и растирают в чашечках стеклянной палочкой, производят нейтрализацию, проверяя рН по универсальному индикатору, доводят рН до 9-10, о чем свидетельствует изменение окраски индикатора до сине-зеленого оттенка. Контролем к стандарту служит дистиллированная вода, к 1 мл которой добавляют 9 мл 0,6 М раствора соляной кислоты. Приготовленной шкалой можно пользоваться в течение недели, сохраняя стандартный раствор в холодильнике в закупоренной пробирке.

Ход определения.
В химическую пробирку вносят 1 мл мочи, добавляют 9 мл 0,6 М раствора соляной кислоты (опыт), перемешивают и отбирают 1 мл разведенной мочи в другую пробирку (контроль).
Опытную пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 мин для гидролиза, в результате которого образуется лактон 4-пиридоксиловой кислоты.
Вынимают из бани, охлаждают и отбирают 1 мл в чистую сухую пробирку (опыт).
В обе пробирки (опыт и контроль) добавляют по 9 мл дистиллированной воды, перемешивают.
Отбирают по 1 мл разведенной мочи (из опытной и контрольной проб) и переносят в фарфоровые чашечки, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой.
В фарфоровые чашечки глазной палочкой добавляют кристаллическую буру (1 -2 порции), растирают стеклянной палочкой до полного растворения.
С помощью универсального индикатора, капли которого наносят на фарфоровую пластинку, проверяют рН исследуемых проб мочи. После нейтрализации и подщелачивания мочи до необходимого значения рН (рН 9-10) окраска индикатора изменяется до сине-зеленого оттенка.
Содержимое чашечек (как исследуемых проб, так и стандарта) сливают в чистые химические пробирки таким образом, чтобы в пробирки не попали оставшиеся кристаллики буры.
По стандартному раствору калибруют прибор так, чтобы показания гальванометра равнялись 20 или 40 делениям. Затем сравнивают флюоресценцию опытной и контрольной проб со стандартным раствором.
Расчет количества выделенной с мочой 4-пиридоксиловой кислоты производят по формуле:
Tjr 0,08 х (О - К) xV х 1,109
X = —                                                                                    —, где
0,01 х 40 - Кст
X - количество выделенной за сутки 4-пиридоксиловой кислоты, мг;

• - суточный объем мочи, мл;

О              - показание флюориметра для опытной пробы;
К - показание флюориметра для контрольной пробы;

0. 08 - концентрация лактона в стандарте, мкг/мл;

0. 01 - объем мочи, взятой для исследования, мл;

40 - установленное показание для стандарта на шкале флюориметра;
Кст - показание флюориметра для контроля к стандарту;
1,109 - коэффициент пересчета лактона 4-пиридоксиловой кислоты в 4- пиридоксиловую кислоту.
Коэффициент для перевода содержания 4-пиридоксиловой кислоты в моче из мг/сут в мкмоль/сут - 5,91.
Норма экскреции 4-пиридоксиловой кислоты за сутки: 4,73-14,8 мкмоль (0,8-2,5 мг); часовая натощак: 0,29-0,35 мкмоль (50-60 мкг).
Принцип метода: Определение витамина А и каротиноидов основано на их гидролизе в щелочном спиртовом растворе с последующей экстракцией смесью органических растворителей.
Реактивы.

1. 11 М раствор гидроксида калия (КОН).
2. 96% этиловый спирт.
3. 1 М раствор гидроксида калия (КОН) в 96% этиловом спирте: 1 объем

11. М раствора КОН смешивают с 10 объемами 96% этилового спирта. Реактив готовят в день проведения исследования. Если при смешивании появляется окрашивание, спирт перед использованием следует очистить перегонкой.

4. Ксилол, х.ч.
5. Октан, х.ч.
6. Ксилол-октановая смесь: готовят путем смешивания равных объемов ксилола и октана.

Исследования проводят на спектрофотометре.
Ход определения.
Взятую из пальца кровь (около 1 мл) вносят в центрифужную пробирку и ставят на 20-30 мин в стеклянный стаканчик с теплой водой (температура 40-45° С). Для отделения сыворотки сгусток крови осторожно обводят тонкой стеклянной палочкой по краю у стенок пробирки и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.
Отбирают 0,12 мл сыворотки и переносят в агглютинационную пробирку, куда затем добавляют 0,12 мл 1 М спиртового раствора гидроксида калия. Содержимое тщательно встряхивают.
Пробирки с пробами ставят в водяную баню на 20 мин при температуре 60° С для проведения гидролиза.
Пробы охлаждают и к ним приливают по 0,12 мл ксилол-октановой смеси, интенсивно встряхивают в течение 10—15 с. Вновь охлаждают и центрифугируют.
Осторожно извлекают пастеровской пипеткой с резиновым баллончиком верхний слой, содержащий витамин А и каротиноиды, и переносят в микрокюветы.
Пробы спектрофотометрируют при длине волны 328 нм - для определения витамина А, и при длине волны 460 нм - для определения каротиноидов.
После спектрофотометрии исследуемые пробы подвергают ультрафиолетовому облучению для разрушения витамина А. Для этих целей на расстоянии 15-20 см от микрокювет устанавливают кварцевую (бактери-
цидную) лампу таким образом, чтобы облучению подвергалась часть кюветы, заполненной жидкостью; время облучения 45-60 мин.
Пробы повторно спектрофотометрируют при длине волны 328 нм. Содержание витамина А определяют по разности величин экстинкций (оптической плотности) с учетом коэффициента (фактора) 637, вычисленного Bessey для витамина А.
Расчет проводят по формуле:
X = 637 * (Е328(1) - Е328(2)Х
где X - содержание витамина А, мкг/дл; 637 - коэффициент, вычисленный Bessey для определения витамина А; Е328(1) - оптическая плотность раствора до облучения; Е328(2)- оптическая плотность раствора после облучения.
Коэффициент для перевода концентрации витамина А из мкг/дл в мкмоль/л - 0,035.
Содержание каротиноидов рассчитывают по формуле:
X = 480-Е480,
где X - содержание каротиноидов, мкг/дл; 480 - коэффициент, вычисленный Bessey для определения каротиноидов; Е480 - оптическая плотность исследуемого раствора.
Примечание. Согласно данным Bessey, при проведении исследований можно брать больший или меньший объем сыворотки, однако соотношение его с объемом спиртового раствора должно быть постоянным при любом изменении объема (количества) ксилол-октановой смеси.
Норма в содержании витамина А в сыворотке крови составляет: у новорожденных и грудных детей - 160-270 мкг/л; у взрослых - 1,05-2,45 мкмоль/л (300-700 мкг/л). Содержание каротиноидов в сыворотке крови взрослых - 800-2300 мкг/л.