Принцип метода. Методика основана на способности раствора рибофлавина давать в ультрафиолетовых лучах яркую желто-зеленую флюоресценцию, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации рибофлавина.
Реактивы.

1. 30% раствор гидроксида натрия (NaOH).
2. 1% раствор гидроксида натрия (NaOH).
3. 20% раствор серной кислоты (K2SO4).
4. 1% раствор серной кислоты (Н2 SO4).
5. Уксусная кислота ледяная (СН3СООН).
6. 4% раствор перманганата калия (КМпО4).
7. Пергидроль.
8. Бромтимоловый синий.
9. Основной стандартный раствор витамина В2 с содержанием рибофлавина 100 мкг/мл: 10 мг рибофлавина вносят в мерную колбу на 100 мл, приливают 50-60 мл дистиллированной воды. Растворяют при нагревании, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Раствор устойчив в течение 2-3 мес.
10. Рабочие стандартные растворы с концентрацией рибофлавина 1, 2, 3, 4 мкг в 1 мл. Готовят перед проведением исследования разведением основного стандартного раствора: 1, 2, 3, 4 мл основного стандартного раствора (абсолютное содержание рибофлавина - 100, 200, 300, 400 мкг соответственно) доводят в мерных колбах до объема 100 мл дистиллированной водой. Хранят в холодильнике. Рабочие стандартные растворы пригодны для работы в течение 4-5 дней.

Ход определения.
Работу рекомендуется проводить при неярком освещении. Для анализа необходимо брать прозрачную мочу. В случае наличия мутности мочу фильтруют.
Подготавливают мочу для контрольного опыта. В коническую колбу на 100 мл или 50 мл вносят 3 мл мочи, добавляют 1 мл 30% раствора гидроксида натрия и 5 мл дистиллированной воды. Ставят на песочную баню
или электрическую плитку с закрытым нагревательным элементом и упаривают пробу до объема 3-4 мл. Витамин В2 при кипячении в щелочной среде разрушается. Пробы охлаждают, затем нейтрализуют 20% раствором серной кислоты. В конце нейтрализации применяют 1% раствор серной кислоты. Окончание нейтрализации устанавливают по индикатору бромтимоловому синему капельным методом или по универсальной индикаторной бумаге. После нейтрализации жидкость переносят в мерный цилиндр на 10 мл. Объем мочи доводят дистиллированной водой до удвоенного объема (если мочи было взято 3 мл, то доводят дистиллированной водой до 6 мл) и после фильтрования (если раствор мутный) в пробирки для контрольного опыта (“К”) отмеряют по 2 мл разведенной мочи, что будет соответствовать 1 мл не разведенной мочи.
В пробирки для определения витамина В2 (“О”) вносят по 1 мл не- разведенной мочи из суммарного суточного количества.
Готовят серию рабочих стандартных растворов с содержанием рибофлавина 1, 2, 3, 4 мкг в 1 мл. В пробирки (“Ст”) вносят по 1 мл каждого раствора стандарта, обрабатывают как опытные пробы. Г отовят контроль к стандарту (“Кст” вносят 1 мл дистиллированной воды и обрабатывают как стандарт.
Во все пробирки (“О”, “К”, “Ст”, “Кст”') добавляют дистиллированную воду до объема 6 мл, встряхивают.
В каждую пробирку (“О”, “К”, “Ст”, “Кст”) добавляют по 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, смешивают и приливают по 1,5 мл 4% раствора перманганата калия (КМп04), тщательно перемешивают содержимое. При этом окисляются посторонние флюоресцирующие вещества. Одновременно ведут обработку не более 4-5 проб, так как перманганат калия является сильным окислителем и может вызвать разрушение рибофлавина.
Затем добавляют пергидроль по каплям до просветления проб, интенсивно встряхивая после прибавления каждой капли (обычно достаточно

2. 3 кап.).

Пробирки оставляют стоять 10-15 мин до прекращения выделения пузырьков газа.
Интенсивность флюоресценции измеряют на флюориметре.
Расчет содержания рибофлавина в суточном количестве мочи проводят по формуле:
„ С х (О - К) xV
X = —^              lt;-— , где
а - Кст
X - содержание рибофлавина в суточной моче, мкг;
С - концентрация рибофлавина в стандартном растворе, мкг/мл;
О - показание флюориметра для опытной пробы мочи;
К - показание флюориметра для контрольной пробы мочи; а - показание флюориметра для стандартного раствора;
Кст - показание флюориметра для контрольной пробы к стандарту;

• - суточный объем мочи, мл.

Коэффициент для перевода содержания рибофлавина из мкг/сут в мкмоль/сут - 0,00266.
В норме суточное содержание витамина В2 в моче составляет 0,792,66 мкмоль (300-1000 мкг); часовое натощак - 0,04-0,08 мкмоль (15-30 мкг).

5. Определение N-метилникотинамида в моче по Хуффу и

Перлцвейгу
Принцип метода. N-метилникотинамид в щелочной среде конденсируется с ацетоном, образуя вещество с ярко-зеленой флюоресценцией, переходящее под действием кислоты в устойчивое соединение с синей флюоресценцией.
Реактивы.

1. М раствор гидроксида натрия (NaOH), свободного от карбонатов: готовят соответствующим разведением из более концентрированного 12 М раствора. Емкости с раствором закрывают пробками с поглотительными трубками, заполненными натронной известью.
2. М раствор соляной кислоты: концентрированную кислоту с относительной плотностью 1,26 разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1.
3. Ацетон: для очистки от флюоресцирующих примесей подвергают перегонке или обрабатывают активированным древесным углем.
4. 20% раствор дигидрофосфата калия (КН2РО4). Готовят в день исследования.
5. Основной стандартный раствор N-метилникотинамида:              10 мг N-

метилникотинамида вносят в мерную колбу на 100 мл, .растворяют в 40-50 мл 0,1 М раствора соляной кислоты, доводят объем до метки. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Стандартный раствор пригоден в течение 4-6 мес.

6. Рабочие стандартные растворы с содержанием 2 и 4 мкг в 1 мл: готовят разведением соответственно 2 и 4 мл основного стандартного раствора в мерных колбах на 100 мл М раствором соляной кислоты.

Ход определения.
Мочу разводят в 10 раз: к 1 мл мочи прибавляют 9 мл дистиллированной воды.
В две химические пробирки (лучше градуированные на 10 мл) отбирают по 1 мл разведенной мочи.
В одну из пробирок добавляют 0,5 мл ацетона (опыт - “О”), в другую

• 0,5 мл дистиллированной воды (контроль на посторонние флюоресцирующие вещества - “К”). Пробирки встряхивают.
  

В обе пробирки (“О” и “К”) быстро добавляют по 0,2 мл 6 М раствора гидроксида натрия, стараясь внести его непосредственно в содержимое пробирки, перемешивают и оставляют стоять 5 мин.
Затем прибавляют по 0,3 мл 6 М раствора соляной кислоты, перемешивают и помещают обе пробирки в кипящую водяную баню на 2 мин.
Охлаждают, добавляют в обе пробирки по 1 мл свежеприготовленного 20% раствора дигидрофосфата калия и 7 мл дистиллированной воды (до объема 10 мл), встряхивают после добавления каждого реактива.
Одновременно с пробами мочи обрабатывают стандартные растворы (“Ст”) и контроль на реактивы (“Кст”). Для этого отмеривают в пробирки по 1 мл рабочего стандартного раствора, содержащего соответственно 2 и 4 мкг в 1 мл. В контрольную пробирку вносят 1,0 мл дистиллированной воды. Во все пробирки наливают по 0,5 мл ацетона, встряхивают, затем прибавляют струей, направленной точно в содержимое пробирки, по 0,2 мл

6. М раствора гидроксида натрия. Дальше обработку ведут так же, как и опытных проб.

Флюоресценцию измеряют на флюориметре с первичным и вторичными фильтрами для фолиевой кислоты.
Расчет содержания N-метилникотинамида в суточном объеме мочи проводят по формуле:
„ Сст x (О - К) x V
Х =              ^              lt;-              , где
аx1000
Х - содержание N-метилникотинамида в суточной моче, мг;
Сст - концентрация N-метилникотинамида в стандартном растворе, мкг/мл;
О - показание флюориметра для опытной пробы;
К - показание флюориметра для контрольной пробы; а - показание флюориметра для стандартной пробы (за вычетом контроля на реактивы);
1000 - коэффициент пересчета в миллиграммы;

• - суточный объем мочи, мл.

Коэффициент для перевода содержания N-метилникотинамида в моче из мг/сут в мкмоль/сут - 7,29.
В норме за сутки выделяется 51,3-87,5 мкмоль (7-12 мг); за час натощак - 2,9-3,6 мкмоль (0,4-0,5 мг).