При всем широком разнообразии макро- и микроскопических признаков, а также ультраструктурных, биохимических, иммунологических и генетических параметров, характеризующих новообразования, последние развиваются по определенным законам. Иными словами, у самых разных типов опухолей есть много общего на различных этапах возникновения и роста. Прежде чем обратиться к генетическим причинам и механизмам канцерогенеза, уделим внимание нескольким главным концептуальным принципам. В этой главе речь пойдет только о злокачественных опухолях, ибо именно они по понятным причинам привлекают главное внимание исследователей.

В основе канцерогенеза лежат нелетальные повреждения генетического аппарата (генома) клеток типа мутаций: генных, при которых изменяется количество или последовательность мононуклеотидов в пределах одного гена, или геномных, при которых изменяется число хромосом или их наборов. Во многих случаях мутации генов или генома могут быть обнаружены госпитальным патологоанатомом при наличии соответствующей базы и оборудования. Указанные повреждения генома в соматических (т. е. не половых) клетках могут быть приобретенными вследствие воздействий факторов окружающей среды — химических веществ, радиации, вирусов, — или в клетках зародышей они могут иметь наследственный характер. Генетическая концепция канцерогенеза подразумевает, что популяция опухолевых клеток — это результат размножения, идущего от одной клетки — родоначальницы клона, претерпевшей опухолевую трансформацию. В этом состоит смысл представления о моноклональном развитии опухолей.

Установлено, что основными мишенями генетического воздействия при опухолевой трансформации являются два класса нормальных регуляторных генов: протоон- когены-промоторы (активаторы) роста клеток и канцеросупрессорные гены (антионкогены), тормозящие рост. Мутантные аллели (измененные состояния) протоонкогенов расцениваются как доминантные (преобладающие и препятствующие появлению других состояний), поскольку они трансформируют клетки, несмотря на наличие их нормальных копий. В противоположность этому обе нормальные аллели тумор-супрессорных генов должны быть повреждены для того, чтобы осуществилась трансформация. Поэтому это семейство генов относят иногда к рецессивным онкогенам (проявляющимся в гомозиготном состоянии, т. е. при наличии двух своих идентичных аллелей).

К третьему классу генов, тоже имеющих важное значение в канцерогенезе, относят гены, контролирующие программированную гибель клеток, апоптоз. Функция одних из этих генов узко специфична и подчинена только указанной цели, но некоторые гены этой группы функционируют и как протоонкогены, и как антионкогены [11, 16, 22, 27, 31, 42].

В настоящее время канцерогенез понимается как стадийный, многоступенчатый процесс как на генетическом уровне, так и на уровнях приобретения какого-либо фенотипа. Последний у злокачественных опухолей включает несколько свойств, о которых уже шла речь, а именно: избыточный рост, инвазию, способность к мета- стазированию. Свойства эти приобретаются в ходе прогрессии опухоли, т. е. различных изменений ее фенотипа, обычно в сторону наращивания злокачественности. И конечно, эти изменения полностью определяются и направляются процессами на генетическом уровне, упомянутыми выше. Перейдем к более подробной характеристике этих процессов.

Учение об онкогенах. Принято думать, что эти гены, вызывающие злокачественные новообразования, происходят из протоонкогенов, которые активируют в нормальных клетках физиологическую пролиферацию и диффе- ренцировку. Путь к открытию протоонкогенов оказался извилистым. Поначалу их обнаружили в качестве «попутчиков» в геноме быстро трансформирующих ретровирусов (РНК-содержащих вирусов), которые способны к быстрой индукции опухолей у подопытных животных и к трансформации их клеток in vitro. Молекулярное расчленение генома этих вирусов выявило наличие уникальных трансформирующих последовательностей, названных вирусными онкогенами и не обнаруженных в геноме не трансформирующих ретровирусов. Однако удивительным оказалось то, что последовательности вирусных онкогенов были идентичны некоторым последовательностям ДНК в нормальных клетках. Возникла концепция, что в ходе эволюции ретровирусные онкогены подверглись трансдукции (переносу или захвату) в вирусный геном путем случайной рекомбинации (обмена) с ДНК нормальных клеток, инфицированных вирусом. Поскольку уже существовало название «вирусные онкогены», понятие «протоонкогены» (как бы предшественники вирусных онкогенов) возникло по отношению к их аналогам. В настоящее время для обозначения каждого вирусного онкогена принят трехбуквенный символ, указывающий на онкоген того вируса, из которого он был изолирован. Например, онкоген, содержащийся в вирусе саркомы линии fe, обозначается как v-FES, а онкоген вируса саркомы обезьян (simian sarcoma) — как v-SIS. Соответствующие протоонкогены символизируются еще проще: FES и SIS [10, 11, 16, 27].

Важно отметить, что вирусные онкогены отсутствуют в нескольких РНК-содержащих вирусах, вызывающих новообразования. Примером может служить группа так называемых медленно трансформирующих вирусов, вызывающих лейкемию у грызунов после продолжительного латентного периода. Однако механизм, с помощью которого они осуществляют опухолевую трансформацию, снова подразумевает функции протоонкогенов. Молекулярное исследование клеток, трансформированных такими вирусами лейкемии, показало, что провирусная ДНК всегда определяется в качестве инсерции (вставки) около протоонкогена. Как следствие такой вставки возникают структурные изменения клеточного гена, превращающие его в клеточный онкоген. А сильные ретровирусные активаторы, вставленные в ДНК поблизости от протоонкогенов, приводят к нерегулируемой экспрессии (реализации функции) клеточного гена. Такой вид активации протоонкогена называют инсерционным.

Хотя изучение трансформирующих ретровирусов подопытных животных привело к началу формирования учения об онкогенах, оно не могло объяснить происхождение опухолей человека, которые за редким исключением не вызываются ретровирусами. Возник естественный вопрос, содержат ли опухоли невирусной природы онко- генные последовательности ДНК? Ответ был получен в опытах с трансфекцией ДНК (воспроизведением вируса в клетке путем введения в ее геном изолированной вирусной ДНК). Когда ДНК, изъятую из нескольких разных опухолей человека, ввели in vitro в мышиные фибробласты, то последние претерпели злокачественную трансформацию. Последовал неизбежный вывод, что ДНК в спонтанно возникающих новообразованиях содержит онкоген- ные последовательности, или онкогены. Многие из этих трансформирующих последовательностей оказались идентичны iMS-протоонкогенам, предшественникам вирусных онкогенов Ha-RAS и Ki-RAS вируса мышиной саркомы. Другие же, как, например, онкоген c-ERB В-2, обнаружили совершенно новые формы последовательностей, не встречавшиеся в ретровирусах. Таким образом, считается, что протоонкогены могут становиться онкоге нами при ретровирусной трансдукции или при воздействиях, трансформирующих их in situ в клеточные онкогены [10, 11, 27]. Какими же функциями обладают продукты онкогенов и как происходит превращение протоонкогенов в активные онкогены?

Вначале о белковых продуктах онкогенов. Известно, что онкогены кодируют белки, называемые онкопротеинами. Эти белки напоминают нормальные продукты протоонкогенов, но с тем исключением, что онкопротеины лишены важных регуляторных элементов и их выработка в трансформированных клетках не зависит от факторов роста или других внешних сигнальных субстанций.

Чтобы легче постичь природу и функции онкобелков, следует вспомнить основные этапы физиологической клеточной пролиферации:

а) связывание фактора роста с его специфическим рецептором в плазмолемме;

б) временную и ограниченную активацию рецепторов фактора роста, которая в свою очередь активирует несколько сигнально-преобразующих белков во внутренней пластине плазмолеммы;

в) передачу преобразованного сигнала сквозь цитозоль через систему вторичных мессенджеров;

г) вызов и активацию внутриядерных регуляторных факторов, дающих начало транскрипции ДНК и, в конечном счете, клеточному делению.

Имея в виду эти этапы, мы можем теперь установить виды онкогенов и онкобелков в качестве измененных версий их нормальных копий, а также группировать их по той роли, которую они играют в каскаде сигнальной трансдукции (табл. 5).

В настоящее время известны многие полипептидные факторы роста, стимулирующие пролиферацию нормальных клеток. Предполагается, что целый ряд из них принимают участие и в канцерогенезе. Мутации генов, кодирующих эти факторы, могут превращать их в онко- Некоторые хорошо изученные протоонкогены, типы их активации и опухоли человека, в формировании которых эти онкогены принимают участие Категория

кодируемых

молекул Протоонкогены Механизм Опухоли

человека PDGF-бета (цепь ) SIS Сверхэкспрессия Астроцитома,

остеосаркома Факторы роста ST-1, Сверхэкспрессия Рак желудка, фибробластов INT-2 мочевого пузыря, молочной железы, меланомы Семейство рецептора EGF ERB-B1 Сверхэкспрессия Плоскоклеточный рак легкого ERB-B2 Амплификация Рак молочной железы, яичника, легкого, желудка ERB-B3 Сверхэкспрессия Рак молочной железы Рецептор CSF-1 FMS Точковые мутации Лейкемия Связывающиеся с GTP RAS Точковые мутации Рак легкого, кишки, поджелудочной железы, различные лейкемии Нерецепторная

тирозинкиназа ABL Транслокация Хроническая миелоидная лейкемия, острая лимфобластная лейкемия Активаторы

транскрипции МУС Транслокация Лимфома

Беркитта N-MYC Амплификация Нейробластома, мелкоклеточный рак легкого L-MYC Амплификация Мелкоклеточный рак легкого

генные факторы. Таков пример с протоонкогеном c-SIS, кодирующим бета-цепь фактора роста, деривата тромбоцитов (PDGF). Последний впервые был открыт под видом вирусного онкогена, содержащегося в v-SIS. После этого PDGF был обнаружен в нескольких опухолях человека, особенно в астроцитомах (развивающихся из ас- троцитов глии головного мозга) и остеосаркомах. Более того, выяснилось, что в этих опухолях имеются также рецепторы PDGF и — отсюда возможность для стимуляции аутокринной стимуляции. Хотя такая стимуляция рассматривается как важный элемент в патогенезе ряда опухолей, в большинстве из них ген фактора роста остается не измененным, т. е. без мутации. Чаще же экспрессию и даже сверхэкспрессию генов фактора роста вызывают продукты других онкогенов, таких как RAS, располагающийся вдоль пути сигнальной трансдукции. Указанные продукты вынуждают клетки вырабатывать большие количества факторов роста, например TGF-аль- фа. Как уже говорилось раньше, TGF-альфа связан с эпидермальным фактором роста (EGF) и вызывает пролиферацию путем связывания с рецептором EGF [10, 11, 16, 27].

Кроме c-S/S, в некоторых карциномах пищеварительного тракта и молочной железы активируется группа связанных с ним онкогенов, кодирующих белки, гомологичные (сходные) с факторами роста фибробластов (FGFs), например hst-1, int-2. В меланомах различной локализации, но не в нормальных меланоцитах, экспрессируется цитокин bFGF, относящийся к семейству факторов роста фибробластов. Наконец, мелкоклеточный рак легкого продуцирует бомбезино-подобные пептиды, стимулирующие пролиферацию раковых клеток.

Несмотря на доказанность того, что факторы роста вызывают аутокринную стимуляцию трансформированных клеток, нужно отметить, что избыточная продукция этих факторов сама по себе недостаточна для опухолевой трансформации. Чрезмерная пролиферация клеток во всех случаях только способствует приобретению ими злокачественного фенотипа путем повышения степени риска для спонтанных (самопроизвольных) или индуцированных (чем-либо вызванных) мутаций в клеточной популяции.

Рецепторы факторов роста. Они являются следующим звеном в цепи событий сигнальной трансдукции. Известны несколько онкогенов, кодирующих рецепторы факторов роста. Причем в опухолях обнаружены и структурные изменения, и патологическая сверхэкспрессия этих факторов. Чтобы понять, как мутации могут изменить функцию рецепторов факторов роста, надо вспомнить, что несколько таких рецепторов являются трансмембранными протеинами со следующими доменами: наружным лиганд-связующим и цитоплазматическим тирозинкиназным. При нормальном состоянии рецепторов активность киназы временно активируется путем связывания специфических для каждого рецептора факторов роста. Затем быстро наступает тирозиновое фосфорилирование нескольких субстратов, составляющих звенья митотического каскада. При онкогенных версиях указанных рецепторов их структура и функция обусловлены стойкой активацией тирозинкиназы в цитоплазматическом домене, но без связывания с фактором роста. Следовательно, мутантные рецепторы передают в клетку непрерывные митогенные сигналы. Мутации, поражающие рецепторы факторов роста, приобретают одну из двух форм: укорочение рецептора или точечную мутацию. Показано, что V ERB В, трансформирующий онкоген вируса птичьего эритробластоза, кодирует мутантный рецептор EGF таким образом, что при этом «упускаются» большинство наружных EGF-связующих доменов. Такое укорочение приводит к существенной активации внутриклеточной тирозинкиназы. Сходное укорочение рецептора обнаружено в некоторых астроцитомах человека. Точковые мутации (изменение одной пары оснований), активирующие C-FMS, а также ген, кодирующий рецептор цитокина, колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1, т. е. фактора, обеспечивающего формирование колоний или пролифе- ратов клеток в культуре), выявлены в опухолевых клетках при миелоидной лейкемии. Гораздо чаще, чем мутации, «сводящие с рельсов» регуляторную функцию этих протоонкогенов, встречается сверхэкспрессия нормальных форм рецепторов факторов роста. Обычно вовлечены три члена семейства рецепторов EGF. Примерно в 80% плоскоклеточных карцином легкого, реже в раках мочевого пузыря, пищеварительного тракта, а также в астроцитомах находится в сверхэкспрессированном состоянии нормальная форма C-ERB В1, ген рецептора EGF. В некоторых случаях повышенная экспрессия рецептора происходит от амплификации (сверхудвоений) гена. Но в большинстве других случаев молекулярные условия для повышенной экспрессии рецептора неизвестны. В противоположность этому, ген C-ERB В2, второй член семейства рецепторов EGF, амплифицируется в большом проценте наблюдений аденокарцином молочной железы, яичников, легких, желудка и слюнных желез. Лиганд для C-ERB В2 недавно был идентифицирован, и транскрипты (единицы транскрипции, кодирующие синтез рРНК) этого нового фактора роста открыли в тех же тканях, в которых экспрессирован рецептор [10, 11, 16, 27].

Третий член семейства рецепторов EGF, C-ERB ВЗ, тоже изолированный недавно, находится в сверхэкспрессированном состоянии в карциномах молочной железы. Было высказано предположение, что опухоли со сверхэкспрессией рецепторов факторов роста, скажем, C-ERB В2> могут иметь особую чувствительность к небольшим его количествам, стимулирующим рост, и, следовательно, могут быть более агрессивны. Такая гипотеза подтверждается тем, что высокие уровни белка C-ERB В2 в клетках карциномы молочной железы предвещают скверный прогноз.

Белки, трансдуцирующие (переносящие) сигналы. Сейчас известны несколько онкобелков, которые имитируют функцию нормальных цитоплазматических белков, переносящих сигналы. Молекулы большинства из них локализованы во внутренней пластине плазмолеммы, где они получают сигналы из среды, окружающей клетку, например при активации рецепторов факторов роста, и передают их к клеточному ядру. С биохимической точки зрения указанные белки гетерогенны, однако их группируют в две категории: гуанозин'трифосфат-связующие белки (GTP-proteins, например продукт С-RAS) и тирозинкина- зы, не связанные с рецепторами, например продукт C-ABL. Рассмотрим обе категории [10, 11, 16, 27].

Белки GTP. Включают семейство белков гена RAS и хорошо изученные белки G. Примерно 30% всех опухолей человека содержат мутантные версии белков гена RAS. Причем для карцином толстой кишки, поджелудочной железы и щитовидной железы этот показатель еще выше. Конечно, мутация гена RAS — единственное, наиболее часто встречающееся отклонение доминантных онкогенов в опухолях человека. Известно, что RAS играет важную роль в стимуляции митозов (митогенезе), вызванной факторами роста. Например, блокада функции RAS микроинъекцией специфических антител прекращает пролиферативный ответ EGF, PDGF и CSF-1. Нормальные белки гена RAS мигрируют взад и вперед между активированной формой, передающей сигнал, и неактивным, статическим состоянием. В неактивном состоянии белки гена RAS связывают гуанозин-дифосфат (GDP). Когда клетки стимулируются факторами роста или другими рецепторно-лигандными взаимодействиями, ген RAS становится активированным при замене GDP на GTP. Активированный RAS поочередно возбуждает действующие регуляторы пролиферации: митоген-активи- рованные протеинкиназы и протеинкиназу С. В нормальных клетках активная, передающая сигнал стадия белка гена RAS скоротечна, поскольку активность его гуа- нозинтрифосфатазы (GTP-азы) гидролизует GTP в GDP, возвращая посредством этого белка в его статическое основное состояние. Такой регулярный цикл протеина RAS зависит от двух реакций: обмена нуклеотидами — GDP на GTP — активирующего белок RAS, и гидролиза GTP, превращающего активный GTP-связанный RAS в неактивную GDP-связанную форму. Обе реакции управляются ферментами. Освобождение связанного фосфата GDP из неактивного белка гена RAS катализируется семейством гуаниносвобождающих факторов GRF. Однако более важно то, что активность гуанозинтрифосфата- зы, присущая нормальным белкам гена RAS, может драматическим образом ускоряться протеинами, активирующими GTP-азу (GAPs). Эти широко распространенные протеины связываются с активным геном RAS и увеличивают активность GTP-азы более чем в 1000 раз, приводя к быстрому гидролизу GTP в GDP и завершению сигнальной трансдукции. Таким образом, GAPs действуют в качестве неких «тормозов», предотвращающих неконтролируемую активность гена RAS. Имеется ответ на это тормозящее действие GAPs, которое может быть поколеблено, когда мутации поражают ген RAS. Протеины мутантного RAS связываются с GAP, однако активность их GTP-азы не увеличивается. Следовательно, мутантные протеины «пойманы» в стимулированной форме, связанной с GTP и в свою очередь вызывающей патологическую активацию митогенной сигнальной системы. Важность активации GTP-азы при контроле нормального роста подчеркивается еще и тем фактом, что вредная мутация нейрофибромина (NF-1), белка, активирующего GTP-азу, происходит при неоплазии.

В противоположность гену RAS, сигнально-перенося- щая функция протеинов G представляется сейчас намно-

го отчетливее. Только один белок — протеин G — контролирующий активность аденилциклазы (G-альфа-в), расценивается как онкопротеин. Мутантный G-альфа-в обнаружен в клеточных сублиниях опухолей гипофиза, надпочечников и щитовидной железы.

Тирозинкиназы, не связанные с рецепторами. Молекулы этих белков, как и гуанозинтрифосфатсвязующих протеинов, располагаются во внутренней пластине плазмо- леммы и нужны для фосфорилирования внутриклеточных мишеней в ответ на действие наружных стимулов роста. Подобно протоонкогенам, кодирующим рецепторы факторов роста, мутирующие тирозинкиназы, не связанные с рецепторами, повышают киназную активность и превращают их в онкогены. Мутантные формы таких ти- розинкиназ, которые приобрели трансформирующий потенциал, обычно обнаруживаются в виде онкогенов ретровирусов животных : V-ABL, V-SRC, V-FYN, V-FES и многих других. Однако, кроме ABL, они редко активируются в опухолях человека. Протоонкоген ABL обладает тиро- зинкиназной активностью, которая угнетается противодействием регуляторных доменов. Но эта активность бывает «развязанной» при хронической миелоидной лейкемии и некоторых острых лимфобластных лейкемиях, когда ген с-ABL подвергается транслокации со своего обычного места в хромосоме 9 на хромосому 22. Здесь он сливается с частью гена BCR (break-point cluster region, зона ложного точкового кластера) и гибридный ген (химера) обладает мощной активностью тирозинкиназы. И хотя конкретные субстраты, которые фосфорилирует химера ABL-BCR, неизвестны, предполагается, что они регулируют пролиферацию клеток.

Ядерныерегуляторные белки. В конечном счете, все системы или пути сигнальной трансдукции проникают в ядро клетки и воздействуют на большой банк отвечающих генов, которые организуют продвижение клетки через ми тотический цикл. Напомним, что этот процесс — репликация ДНК и деление клетки — регулируется семейством генов, продукты которых локализуются в ядре, где они контролируют транскрипцию генов, связанных с ростом. Поэтому не удивительно, что гены, которые влияют на мутации, кодирующие факторы ядерной транскрипции, ассоциируются со злокачественной трансформацией. Известна внутриядерная локализация множества онкобелков, производных онкогенов МУС, MYB, JUN и FOS. Среди них ген MYC чаще всего участвует в опухолевом процессе у человека, и потому краткое рассмотрение его функции будет оправданно. Протоонкоген C-MYC экспрессируется фактически во всех эукариотных (имеющих ядра) клетках и относится к генам, отвечающим за ранние этапы роста. Он быстро подвергается индукции (включению транскрипции), когда покоящаяся клетка получает сигнал к делению. Вслед за преходящим повышением содержания мРНК гена C-MYC экспрессия снижается до основного уровня. Значение C-MYC в пролиферации клеток подчеркивается еще и тем, что торможение его экспрессии в эксперименте с помощью олигонуклеотидов предотвращает вступление клеток в

S-фазу [10, 11, 16, 27, 31].

Молекулярные основы функции C-MYC в репликации клеток полностью не ясны, но некоторые общие принципы определены. Вслед за трансляцией белок гена C-MYC быстро переносится в ядро. До или после этого он формирует гетеродимер с другим протеином, названным шах. Затем комплекс С-МУС/max связывается со специфическими последовательностями ДНК предположительно поблизости от генов, необходимых для пролиферации клеток. Находясь в этой важной локализации, ген C-MYC активирует транскрипцию соседних генов, связанных с пролиферацией. Подлинность генов, способствующих делению и являющихся мишенями активации с помощью С-МУС, должна быть еще установлена, но несколько кандидатов, включая ген C-SIS, кодирующий бета-цепь PDGF (тромбоцитарного фактора роста), уже опознаны. В противоположность к регулируемой экспрессии гена C-MYC в ходе нормальной пролиферации клеток, онкогенным версиям свойственна стойкая экспрессия, в некоторых случаях даже сверхэкспрессия белка гена C-MYC. Это может приводить к непрерывной транскрипции решающих генов-мишеней и к опухолевой трансформации. Нарушение регуляции экспрессии гена C-MYC встречается при лимфоме Беркитта, В-клеточных опухолях, тогда как усиление N-MYC и L-MYC — в нейробластомах и мелкоклеточном раке легкого.

Теперь об активации онкогенов. Выше речь шла о том, как мутантные формы протоонкогенов могут обеспечивать сигналы, стимулирующие пролиферацию. Теперь следует перейти к механизмам трансформации протоонкогенов в онкогены. Принципиально эти механизмы включают в себя две большие группы процессов: изменения структуры гена, приводящие к синтезу ненормального генного продукта (онкобелка), имеющего функцию, отклоненную от нормы, а также изменения в регуляции экспрессии гена, приводящие к усиленной и несоответствующей продукции нормального по строению белка, стимулирующего пролиферацию. Остановимся подробнее на этих структурных и регуляторных изменениях, поражающих протоонкогены [10, 11, 16, 27, 31].

Точковые мутации. Наилучший пример активации, вызванной точковыми мутациями, представляет собой онкоген RAS. Известны несколько определенных мутаций, эффектно снижающих активность GTP-азы белков RAS. Выше уже говорилось, что внутренняя активность GTP-азы нормального протеина гена RAS в большой мере увеличивается за счет белков (GAPs), активирующих этот фермент. В противоположность этому, активность GTP- азы белков мутантного RAS стимулируется с помощью

GAPs слабо. Таким образом, мутантный RAS остается в активной форме, связанной с GTP.

Мутации гена RAS обнаружены в большом количестве новообразований человека. Частота их находок в разных типах опухолей варьирует, но в некоторых типах она очень высока. Примеры: точковые мутации RAS содержат около 90% панкреатических аденокарцином, примерно 50% раков толстой кишки, эндометрия и щитовидной железы, до 30% аденокарцином легкого и миелоидных лейкемий. Интересно, что мутации этого гена не часты или даже отсутствуют в других распространенных формах рака, таких как карцинома шейки матки или молочной железы. Таким образом, отсутствие в ткани мутаций гена RAS может не отражать отсутствия канцерогенеза. При острой миелоидной лейкемии были найдены активирующие точковые мутации и в другом гене: C-FMS.

Транслокации хромосом. Перераспределение генетического материала при хромосомной транслокации обычно приводит к сверхэкспрессии протоонкогенов, но в некоторых случаях ген может также подвергнуться структурным изменениям. Сверхэкспрессия протоонкогена, вызванная транслокацией, лучше всего иллюстрируется на примере лимфомы Беркитта. При всех вариантах этой неоплазии встречается какая-либо одна из трех транслокаций, характерных для этой лимфомы и вовлекающих как хромосому 8q24, в которой содержится ген С-МУС, так и хромосомы, несущие гены иммуноглобулинов. В нормальных локусах этих хромосом экспрессия гена МУС твердо контролируется и реализуется лишь на определенных стадиях клеточного цикла. При лимфомах Беркитта наиболее частая форма транслокации выражается в перемещении сегмента хромосомы 8, содержащего С-МУС, на 32-ю полосу плеча q хромосомы 14. В результате ген С-МУС оказывается рядом с геном иммуноглобулина тяжелых цепей. Молекулярные механизмы активации С-МУС, связанной с транслокацией, различны, как различны точки разрыва внутри гена. В некоторых случаях транслокация приводит объект гена C-MYC к неуклонной стимуляции с помощью прилежащего иммуноглобулин-несуще- го гена. В других случаях она вызывает мутации регуляторных последовательностей гена C-MYC. При всех ситуациях кодирующие последовательности этого гена остаются интактными, и поэтому он полностью экспрессируется на высоком уровне. Неизменное наличие перемещенного гена C-MYC в лимфомах Беркитта свидетельствует о важности его сверхэкспрессии в патогенезе этой опухоли. Такое представление подтвердили находки В-кле- точных лимфом в опытах на трансгенных мышах — носителях гена МУС, находившегося под контролем иммуноглобулинового усилителя.

При механизме, сходном с тем, который характерен для гена МУС, встречается и сверхэкспрессия гена BCL-2. Фактически во всех фолликулярных В-клеточных лимфомах ген BCL-2, находящийся в позиции 18q21, перемещается в локализацию 14q32, опять-таки рядом с локусом иммуноглобулина тяжелых цепей.

Хорошо известная филадельфийская хромосома, характерная для хронической миелоидной лейкемии и встречающаяся при острых лимфобластных лейкемиях, тоже служит примером генетического повреждения, вызванного транслокацией. При указанных опухолевых процессах в ходе реципрокной транслокации между хромосомами 9 и 22 укороченная часть протоонкогена C-ABL переносится с хромосомы 9 на зоны кластеров точечных разрывов (bcr, breakpoint cluster region) в хромосоме 22. Гибридный ген C-ABL-BCR кодирует химерный (т. е. генетически сочетанный) белок, имеющий тирозинкиназную активность. Несмотря на то что транслокации при хронической миелоидной лейкемии и острых лимфобластных лейкемиях цитогенетически идентичны, они отличаются на молекулярном уровне. В первом случае химерный протеин имеет молекулярный вес 210 килодальтон, в то время как при более агрессивных острых лейкемиях путем слияния формируется несколько отличающийся белок ABL-BCR с весом 180 kd. У последнего белка активность тирозинкиназы гораздо выше, чем у первого. В последнее время патологи и цитогенетики открывают все больше вариантов транслокаций, многие из которых дают начало онкогенным «белкам слияния» в различных опухолевых тканях.

Амплификация генов. Активация протоонкогенов, связанная со сверхэкспрессией их продуктов, может быть результатом редупликации и многократной амплификации их последовательностей в ДНК. В результате такой амплификации в опухолевых клетках могут вырабатываться несколько сотен копий протоонкогенов. Амплифи- цированные гены можно обнаружить с помощью методики гибридизации с соответствующим образцом молекулы ДНК. Кроме того, в некоторых случаях амплифицирован- ные гены вырабатывают такие цитогенетические изменения, которые патолог может обнаружить микроскопически. При этом находят обычно два взаимоисключающих варианта изменений: множественные, мелкие хромосомоподобные структуры, названные сдвоенными мелкими частицами, и гомогенно окрашенные районы. Такие районы возникают при сборке новых хромосом из амплифи- цированных генов. Поскольку эти районы, содержащие указанные гены, не имеют нормального распределения полос, при бэндинге кариотипа они выглядят в качестве однородных зон. Приведем примеры. От 30 до 40% наблюдений нейробластом и карцином молочной железы сопровождаются амплификацией соответственно N-MYC и C-ERB В2, и это — показатель плохого прогноза. Точно такая же корреляция с прогнозом и амплификацией L-MYC и N-MYC отмечена для мелкоклеточного рака легких.

Канцеро-супрессорные гены (антионкогены). Если протоонкогены кодируют белки, способствующие пролиферации клеток, то продукты тумор-супрессорных генов тормозят пролиферацию. Это обстоятельство, как и само название этого подраздела, могут ввести в заблуждение. Однако следует иметь в виду, что физиологической функцией указанных генов является регуляция пролиферации клеток, а не предупреждение формирования опухоли.

Подобно многим открытиям в медицине канцеро-супрессорные гены были обнаружены при изучении редкого заболевания, в данном случае ретинобластомы (злокачественной нейроэпителиомы сетчатки глаза), опухоли младенческого или детского периода, возникающей у одного ребенка из 20 тысяч. Примерно 60% ретинобластом имеют спорадический, а около 40% — наследственный характер. Предполагается, что в последнем случае передача осуществляется по аутосомно-доминантному типу. При попытке объяснить, почему фенотипически идентичные опухоли имеют то спорадическую, то наследственную природу, была выдвинута теперь уже широко известная гипотеза «двух ударов». А. Кнудсон предположил, что в случае наследования от пораженного родителя передается одно генетическое изменение («первый удар»), которое имеется во всех соматических клетках ребенка. В то же время вторая мутация («второй удар») возникает в одной из многих клеток сетчатки, уже претерпевших первую мутацию. В случае спорадического возникновения обе мутации, или оба «удара» происходят в единственной клетке сетчатки, потомки которой формируют опухоль [10, 11, 16, 27].

Мутации, вызывающие появление ретинобластомы, затрагивают ген RB, находящийся в хромосоме 13ql4. В некоторых случаях генетическое изменение настолько велико, что оно имеет характер делеции 13ql4. Для возникновения ретинобластомы обе нормальных аллели в локусе гена RB должны быть инактивированы («два удара»). В случаях наследования дети рождаются с одной нормальной и одной дефектной копией RB. Нормальную копию они теряют в ретинобластах при одной из форм соматической мутации (точковой мутации, межуточной делеции 13ql4 или полной утрате нормальной хромосомы 13). В случаях спорадического возникновения в одном из ретинобластов при соматической мутации утрачиваются обе нормальные аллели в RB. Конечный результат один: та клетка сетчатки, которая утратила обе нормальные копии гена RB, дает начало ретинобласто- ме. Больные, имеющие наследственную передачу опухоли, наделены также риском возникновения у них остеосаркомы, а также некоторых опухолей мягких тканей. Следует отметить, что инактивация локуса RB отмечена и при других новообразованиях: аденокарциноме молочной железы, мелкоклеточном раке легкого, раке мочевого пузыря. Таким образом, утрата гена RB имеет более широкое этиологическое значение в развитии опухолей [10, 11, 16, 27, 32].

Следует дать еще одно терминологическое пояснение. Ребенок, носитель наследованной аллели мутантного гена RB во всех соматических клетках, является совершенно нормальным и не подверженным повышенному риску для канцерогенеза. Поскольку он гетерозиготен по отношению к локусу RB, это означает, что гетерозиготность для гена RB не сопровождается повреждением клетки. Малигни- зация начинается, когда клетка становится гомозиготной для мутантной аллели или же, другим путем, когда она теряет гетерозиготность для нормального гена RB. Так как последний приводит к канцерогенезу тогда, когда утрачены обе нормальные копии, он иногда обозначается как «рецессивный раковый ген», т. е. не проявляющийся в гетерозиготе [32].

Сходным образом действуют в ходе канцерогенеза и ряд других генов. Так, один или более генов короткого плеча хромосомы 11 «виновны» в формировании нефробласто- мы Вильмса, рабдомиосаркомы и гепатокарциномы. Среди более частых опухолей утрата гетерозиготности в определенных локусах хромосом 13,3,5, 17и18 найдена в карциномах молочной железы (хромосома 13), легкого (хромосома 3) и кишки (хромосомы 5, 17, 18). Стойкая и не случайная утрата гетерозиготности указала на ряд локализаций нескольких канцеро-супрессорных генов. Мы затронем четыре вида таких генов: Р53,АРС и NF-1, DCC, WT-1 [10, 11, 16, 27].

Ген Р53. Картированный в хромосоме 17р13.1, этот ген является единственной, наиболее частой мишенью для генетических повреждений при канцерогенезе у человека. Его гомозиготная утрата обнаружена в 70% случаев рака толстой кишки, в 50% карцином легкого и молочной железы. Мутации гена Р53 не ограничены только эпителиальными опухолями и обнаружены также при лейкемиях, лимфомах, саркомах и нейрогенных опухолях. Несмотря на то, что в большинстве случаев мутации Р53 в соматических клетках являются приобретенными, описаны и наследственные формы его повреждения. Как и для гена Rb, наследование мутантного аллеля Р53 при синдроме Ли-Фраумени является предрасполагающим фактором к канцерогенезу. Однако в противоположность лицам, наследующим ген RB, больные с указанным синдромом имеют высокую степень риска развития разнообразных злокачественных новообразований, включая рак молочной железы, саркомы, опухоли головного мозга.

Гены АРС и NF-1. Они сходны с геном RB, тоже участвуют в патогенезе наследственных неоплазий, но с некоторым отклонением в механизме действия (АРС — это сокращение трех английских слов «аденоматозный поли- поз кишки», NF — сокращение слова «нейрофиброма- тоз»). Обнаружено, что мутации в локусах АРС и NF-1 в клетках зародышевых линий связаны с возникновением вначале доброкачественных опухолей, а затем карцином. Наследуемая утрата одного аллеля гена АРС располагает к развитию множественных полипов кишки на второй- третьей декаде жизни при семейном полипозе и синдроме Гарднера. Какая-то часть полипов позднее малигнизиру- ется. В этой связи возникают вопросы: является ли наследуемая мутация, повреждающая одну копию гена АРС, достаточной для появления опухолей, пусть даже доброкачественных полипов (аденом), и является ли инактивация второй аллели в ходе соматической мутации необходимой для малигнизации полипа? Если это имеет место, что весьма вероятно, то в противоположность многим другим ту- мор-супрессорным генам ген АРС может оказаться не рецессивным на клеточном уровне.

Помимо упомянутых случаев малигнизации на основе семейного полипоза толстой кишки, мутации гена АРС найдены при обычных (не наследственных) аденомах и карциномах этого органа. Причем только в 30% таких наблюдений отмечена гомозиготная утрата гена АРС. Поэтому инактивация обеих аллелей может не быть необходимой для развития опухолей. Следует также добавить, что утрата гена АРС встречается в некоторых карциномах желудка и поджелудочной железы.

Ген NF-1 отличается сходным механизмом действия. Лица, наследующие его мутантный аллель, имеют обычно множественну