Непрямые методики (рис. 4.10) применяют чаще, чем прямые.
Непрямым иммуноанализом называют анализ, в котором метку присоединяют не к целевому антигену и не к антителу против целевого антигена, а к так называемым вторым антителам — антивидо- вым антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают.

Рис. 4.10. Принцип непрямых иммуноанализов
Таким образом, один и тот же препарат конъюгата антиглобули- новых антител с ферментом используют в качестве проявляющего стандартного реагента в разных тест-системах для определения различных конкретных антигенов или антител.
Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с ферментом может быть использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека. Все описанные схемы постановки прямого варианта ИФА (конкурентный, ингибиторный, «сэндвич», иммунометрический) применяют и в непрямом варианте.
Непрямые варианты ИФА не требуют очистки искомых антигенов или антител. Чистым должен быть только препарат антивидовых антииммуноглобулиновых антител.
В качестве ферментов-меток в ИФА используются следующие ферменты и субстраты для них.
1. Пероксидаза из корней хрена, субстраты:
• орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);

• 3,3-диаминобензидин (продукткоричневый, нерастворимый);
• З-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый);
• 5-аминосалициловая кислота (продукт коричневый, растворимый, поглощает при 405 нм);
• 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота (продукт зеленый, растворимый, поглощает при 405 нм);
• 4-хлоро-1-нафтол (продуктголубой, нерастворим); 3,3'-диметокси- бензидин (продукт желто-оранжевый, растворимый, поглощает при 405 нм);
• 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (продукт голубой, растворимый, поглощает при 450 нм);
• ABTS — 2,2’-азино-ди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота.

2. (3-Галактозидаза (субстраты — дериваты (3-галактозида, например 4-метилумбелиферил-(3-В-галактозин).
3. Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм).
4. Уреаза (субстрат — мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).

Нерастворимые продукты ферментативных реакций используют в методах иммуногистохимии и иммуноблота, растворимые — в иммуноферментных анализах, в которых результат регистрируют количественно спектрофотометрически.
Встречаются оригинальные разработки с использованием других (кроме вышеперечисленных) ферментов-меток.
Если по тем или иным биохимическим причинам заданный антиген или интересующее антитело не удается конъюгировать с меткой без существенных потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Например, нередко используют так называемое «авидин- биотиновое» взаимодействие. Авидин — белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин — витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 М) связывает биотин. Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела (существуют коммерческие препараты). Соответственно все эти дополнительные компоненты используют при необходимости в конструкциях тест-систем, предназначенных для детекции того или иного заданного вещества. Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii.
В конкретных вариантах тест-систем используют разные буферные растворы, соответствующие свойствам конкретных антигенов, ферментов и их субстратов. Для примера мы опишем последовательность действий и используемые реагенты при выполнении непрямого твердофазного иммуноанализа, его простой и часто встречающийся вариант, подходящий, в частности, для определения специфических противовирусных антител как маркера наличия в организме той или иной вирусной инфекции (специфическую лабораторную диагностику вирусных инфекций применяют для выявления инфицированности ВИЧ, вирусами гепатитов, герпеса, цитомегаловирусами и др.).