ВВЕДЕНИЕ
Иммунологии вскоре предстоит занять весьма важное место в структуре фундаментального медико-биологического образования. Мы не знаем ни одного даже самого узкого медицинского специалиста, способного обойтись без иммунологии: она нужна либо для понимания патогенеза болезней, либо для проведения иммуноанализов, а чаще и для того, и для другого. Но хотя в практике клинических и биологических исследований иммунологические методы лидируют, в программе шестилетнего высшего врачебного образования почти не предусмотрено их профессиональное изучение. Не зная технологий современных иммуноанализов, врач не в состоянии самостоятельно понять, что факт наличия той или иной инфекции в крови пациента (положим, ВИЧ) можно надежно установить с вероятностью 100% (пусть для этого надо будет выполнить не одно, а несколько разных исследований), а вот факт отсутствия инфекции нельзя надежно установить никакими методами.
Цель данного учебного пособия — познакомить студентов и врачей на профессиональном уровне с современными методами исследования, используемыми в экспериментальной и клинической иммунологии с аллергологией. Приведены основные характеристики и этапы использования разнообразных иммунологических методов, часть которых легко воспроизвести в рамках практических занятий на кафедре иммунологии и на смежных кафедрах медицинских и биологических вузов.
Иммунологические методы, применяемые как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, делятся по крайней мере на 8 групп.
I. Методы определения или детекции тех или иных веществ, характеризующихся наличием уже полученных специфичных антител против них. Эти методы принято называть в международной специальной литературе методами иммуноанализа. В соответствии с применяемыми технологиями визуализации взаимодействия антитела и антигена иммуноанализ подразделяется на:
а) методы агглютинации корпускулярных антигенов (непосредственная агглютинация антигена, гемагглютинация, латекс- агглютинация, нефелометрия);
б) методы с использованием технологии гемолиза (тесты фиксации комплемента, торможения фиксации комплемента, метод подсчета антителообразующих клеток по Йерне);
в) методы преципитации комплексов «антиген—антитело» в гелях (методы Оухтерлони, Элека, Манчини и др.);
г) иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, имму- нофлюоресцентный анализ — наиболее высокочувствительные и наиболее употребимые в настоящее время виды иммуноанализа.
а) выделение иммуноглобулинов высаливанием солями серной кислоты;
б) методы хроматографии (высокоэффективная; аффинная и др.);
в) центрифугирование в средах с градиентами плавучей плотности (выделение мононуклеарных клеток центрифугированием на фиколл-гепаке; выделение нейтрофилов седиментацией на растворе желатина, декстрана и др.);
г) электрофорез;
д) проточная цитофлюорометрия, в том числе с использованием тетрамерных комплексов.
а) методы направленного мутагенеза — «нокаут» и «нокин»;
б) методы изучения экспрессии генов и методы картирования и исследования конкретных мутаций (технологии микроэрреев).
др.).
Проводится наиболее детальное описание некоторых тестов, подходящих для практических занятий со студентами (обозначения: «Лабораторная работа 1-1» и т.д.).
Особое внимание в книге уделяется проблеме цитокинов. В соответствующем разделе не только представлены конкретные методы их идентификации, но и сформулирован подход к оценке системы цитокинов в целом, что очень способствует формированию суждения о комплексности этой важнейшей для организма системы межклеточных медиаторов. Особо подчеркнем: сейчас в клинической медицине отмечается рост числа патологических процессов, обусловленных избыточной или недостаточной продукцией цитокинов.
Цель данного учебного пособия — познакомить студентов и врачей на профессиональном уровне с современными методами исследования, используемыми в экспериментальной и клинической иммунологии с аллергологией. Приведены основные характеристики и этапы использования разнообразных иммунологических методов, часть которых легко воспроизвести в рамках практических занятий на кафедре иммунологии и на смежных кафедрах медицинских и биологических вузов.
Иммунологические методы, применяемые как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, делятся по крайней мере на 8 групп.
I. Методы определения или детекции тех или иных веществ, характеризующихся наличием уже полученных специфичных антител против них. Эти методы принято называть в международной специальной литературе методами иммуноанализа. В соответствии с применяемыми технологиями визуализации взаимодействия антитела и антигена иммуноанализ подразделяется на:
а) методы агглютинации корпускулярных антигенов (непосредственная агглютинация антигена, гемагглютинация, латекс- агглютинация, нефелометрия);
б) методы с использованием технологии гемолиза (тесты фиксации комплемента, торможения фиксации комплемента, метод подсчета антителообразующих клеток по Йерне);
в) методы преципитации комплексов «антиген—антитело» в гелях (методы Оухтерлони, Элека, Манчини и др.);
г) иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, имму- нофлюоресцентный анализ — наиболее высокочувствительные и наиболее употребимые в настоящее время виды иммуноанализа.
- Методы фракционирования — физическое разделение растворимых молекул или клеток иммунной системы:
а) выделение иммуноглобулинов высаливанием солями серной кислоты;
б) методы хроматографии (высокоэффективная; аффинная и др.);
в) центрифугирование в средах с градиентами плавучей плотности (выделение мононуклеарных клеток центрифугированием на фиколл-гепаке; выделение нейтрофилов седиментацией на растворе желатина, декстрана и др.);
г) электрофорез;
д) проточная цитофлюорометрия, в том числе с использованием тетрамерных комплексов.
- Иммуногистохимические методы (иммунофлюоресцентная микроскопия; микроскопия препаратов тканей или клеток с фиксированными антителами, меченными ферментной меткой).
- Методы молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция; иммуноблоттинг: Western-блот определяет белок, Southern-блот определяет ДНК, Northern-блот определяет РНК).
- Генетические методы:
а) методы направленного мутагенеза — «нокаут» и «нокин»;
б) методы изучения экспрессии генов и методы картирования и исследования конкретных мутаций (технологии микроэрреев).
- Методы биотехнологии — клонирования молекул, ПЦР, методы получения рекомбинантных белков, клеток (гибридомные технологии), создание линий инбредных животных, биотехнологические методы получения и оценки вакцин.
- Методы изучения свойств нативных клеток иммунной системы в культурах in vitro (методы биологического тестирования цитокинов; методы оценки пролиферации клеток; методы исследования факторов транскрипции и др.).
- Методы исследования функций и взаимодействия клеток in vivo (радиационные химеры; сканирование меченых клеток in vivo и
др.).
Проводится наиболее детальное описание некоторых тестов, подходящих для практических занятий со студентами (обозначения: «Лабораторная работа 1-1» и т.д.).
Особое внимание в книге уделяется проблеме цитокинов. В соответствующем разделе не только представлены конкретные методы их идентификации, но и сформулирован подход к оценке системы цитокинов в целом, что очень способствует формированию суждения о комплексности этой важнейшей для организма системы межклеточных медиаторов. Особо подчеркнем: сейчас в клинической медицине отмечается рост числа патологических процессов, обусловленных избыточной или недостаточной продукцией цитокинов.