Доимплантационная диагностика (ДД) появилась в 90-е годы прошлого века благодаря быстрому развитию методов вспомогательной репродукции и микрометодов, приемлемых для анализа генома единичных клеток, таких как методы молекулярной цитогенетики (различные варианты FISH) и молекулярной генетики (варианты ПЦР). В настоящее время список наследственных болезней, доступных для диагностики на доимплантационных стадиях, включает не только многие моногенные (муковисцидоз, фенилкетонурию), но и различные хромосомные болезни. Спектр заболеваний в настоящее время насчитывает более 30 нозологий и включает все наиболее частые моногенные и хромосомные болезни [498]. К 2001 году в мире проведено около 2500 доимплантационных диагностик. После селекции больных и трансплантации в матку здоровых эмбрионов в 500 случаях родились здоровые дети. В России доимплантационная диагностика делает только первые шаги и проводится лишь в нескольких центрах вспомогательных репродуктивных технологий Москвы, Санкт-Петербурга, Красноярска. Причем и в этих центрах она пока ограничена диагностикой пола плода (планирование семьи и Х-сцепленные заболевания), а также исключением наиболее частых хромосомных болезней.
Следует напомнить, что материалом для доимплантационной диагностики являются полярные тельца или отдельные бластомеры дробящейся яйцеклетки, полученные микрургическим путем от доимплантационных зародышей — продуктов экстракорпорального оплодотворения (см. главу 4). В зависимости от материала доимплантационную диагностику можно подразделить на преконцепционную (анализ полярных телец) и собственно доимплантационную (анализ бластомеров или клеток трофобласта).
Диагностика с использованием полярных телец позволяет выбирать для оплодотворения ооциты, не несущие генные и геномные мутации. Основная проблема — большая вероятность неточного прогноза о генотипе ооцита при тестировании только первого полярного тельца. Определить наличие мутации можно только после завершения второго деления мейоза, то есть по второму полярному тельцу, которое образуется уже после оплодотворения яйцеклетки.
Вторая проблема обусловлена особенностями применения молекулярно-генетических методов для диагностики единичной клетки. На результаты ПЦР могут повлиять различные факторы, в частности, контаминация образца или условия проведения реакции.
Проблема цитогенетического анализа полярных телец заключается в невозможности применения традиционных методов анализа метафазных хромосом. Поэтому для этих целей обычно используют метод гибридизации in situ с меченными флуорофорами ДНК-зондами, специфичными к участкам отдельных хромосом. В последние годы разработаны и апробированы методы приготовления хромосом из полярных телец человека, пригодных для стандартного цитогенетического анализа. Предложенные модификации уже позволили провести анализ хромосомного набора в полярных тельцах с эффективностью 94,1 % [725, 871].
Таким образом, возможности для преконцепционной диагностики наследственных болезней уже реально существуют, однако, насколько нам известно, в России они пока не применяются. Сложности работы с единичными клетками и большая вероятность диагностических ошибок не оправдывают значительных финансовых затрат на проведение преконцепционной диагностики.
Диагностика на изолированных бластомерах позволяет получить точную информацию о генотипе эмбриона. В основном, биопсия бластомеров осуществляется на стадии 8-10 клеток. Поскольку на ранних стадиях дробления все бластомеры тотипотентны (т. е. взаимозаменяемы), удаление 1-2 клеток не сказывается на дальнейшем развитии эмбриона. Методически анализ единичных бластомеров от дробящихся зародышей принципиально не отличается от анализа полярных телец.
Выбор метода молекулярной диагностики определяется спецификой исследуемой мутации и включает как метод ПЦР, так и более сложные ДНК-методы. Они позволяют проводить диагностику наиболее распространенных моногенных болезней — аутосомно- рецессивных (муковисцидоз, Р-талассемия, спинальная амиотрофия Верднига-Гоффмана, болезнь Тея-Сакса), аутосомно-доминантных (миотоническая дистрофия, синдром Марфана, хорея Гентингтона), Х-сцепленных (миодистрофия Дюшенна и синдром ломкой X- хромосомы), а также некоторых более редких болезней.
Цитогенетическая доимплантационная диагностика проводится на 1-2 бластомерах методом FISH с использованием ДНК-зондов, специфичных к прицентромерным или теломерным районам хромосом 16, 18, 21, 13, X, Y. При гетерозиготном носительстве транслокации одним из родителей для диагностики методом FISH используются цельнохромосомные и локус-специфичные ДНК-зонды.
Проблема диагностики численных аномалий кариотипа осложняется высокой частотой хромосомного мозаицизма на ранних стадиях эмбриогенеза человека. Доимплантационная диагностика на этой стадии может быть рекомендована только в группах высокого риска рождения ребенка с наследственной патологией.
Более надежная доимплантационная диагностика может быть проведена на стадии бластоцисты. На этой стадии зародыш состоит примерно из 60-100 клеток. При визуализации трофобласта и эмбрио- бласта без ущерба для развития эмбриона можно удалить до 10 клеток трофобласта. Следует, однако, учитывать, что культивирование эмбрионов in vitro в программах ЭКО крайне редко доводят до стадии бластоцисты, т. к. способность к имплантации таких эмбрионов может оказаться существенно сниженной.
Удивительные возможности доимплантационной диагностики в сочетании с другими методами вспомогательных репродуктивных технологий наглядно продемонстрированы в исследованиях, проведенных в Институте генетики репродукции человека в Чикаго (США) [724]. Цель работы заключалась в попытке лечения 5-летней девочки, страдающей анемией Фанкони, обычно приводящей к смерти вследствие аплазии костного мозга.
Для этого от матери больного ребенка путем искусственной гормональной стимуляции с последующим оплодотворением in vitro сперматозоидами мужа были получены более 30 зародышей. С помощью молекулярных методов вначале была проведена селекция зародышей, лишенных мутации гена анемии Фанкони. На втором этапе путем тестирования генов локуса HLA были отобраны здоровые зародыши, гистосовместимые с клетками больной девочки. После трансплантации в матку матери удалось выносить и родить здорового мальчика, пуповинная кровь которого, полученная при рождении, была использована в качестве донорской для больной девочки. Благодаря содержащимся в пуповинной крови стволовым кроветворным клеткам девочка была спасена. В настоящее время брат и сестра соматически вполне здоровы. Естественно, что такое исцеление стало возможным благодаря серьезным успехам не только в доимплантационной диагностике, но и в других современных технологиях, включая клеточную терапию с использованием стволовых клеток.
Таким образом, основное (и зачастую, единственное) преимущество диагностики до имплантации заключается в возможности трансплантации генетически полноценных эмбрионов. Недостатками этого подхода являются методические трудности, связанные с необходимостью работы с микроколичествами материала, ограничения диагностики рамками программ ЭКО и большая вероятность ошибочной диагностики.
Доимплантационная диагностика в России пока не имеет широкого распространения. Она проводится только в нескольких ведущих центрах ЭКО, весьма дорогостоящая, требует специально подготовленных специалистов, оборудования и реактивов, чревата повышенной частотой ошибок. После диагностики до имплантации и наступления беременности нередко возникает необходимость проведения стандартной ПД на постимплантационных стадиях.
Более детально с методами, возможностями и ограничениями ПД в доимплантационный период можно ознакомиться в соответствующих руководствах и монографиях [384, 871, 873].