В предыдущих разделах мы неоднократно обращались к процессу метилирования ДНК как к универсальному механизму регуляции генной активности. Напомним, что согласно наиболее общепринятой точке зрения, выключение работы структурных генов происходит в результате метилирования CpG-нуклеотидов в промоторных частях гена, вследствие чего становится невозможной посадка на ДНК фермента РНК-полимеразы II, и процесс транскрипции полностью блокируется [84]. Метилирование лежит в основе таких важных биологических феноменов как геномный импринтинг, аллельное исключение, инактивация Х-хромосомы, оно играет важную роль в процессах онкогенеза [121, 128, 746, 883]. Исследовать метилирование на цитологическом уровне можно при помощи реакции ник-трансляции с использованием метил-зависимой эндонуклеазы НраП (см. главу 10) либо путем гистохимического выявления участков хромосом, насыщенных метилированными CpG-последовательностями, с помощью специфических антител к метилцитозину (см. главу 10) [307]. В результате проведенных исследований уже получены ориентировочные данные, свидетельствующие о следующем: 1) в С-гетерохроматине некоторых хромосом могут находиться структурные гены, 2) характер метилирования хромосом в клетках хориона (плаценты) отличается от такового в клетках собственных эмбриональных тканей, 3) паттерны метилирования гомологичных хромосом в клетках плаценты могут быть разными. Последние две находки позволили предполагать, что активность хромосом (генов) в хорионе отлична от таковой в собственно эмбриональных тканях, и что функции материнских и отцовских хромосом в клетках провизорных органов, прежде всего, в плаценте, отличаются. Все эти предположения имеют большой научный и практический интерес. Их прямая проверка с помощью других методов и подходов, особенно методами молекулярной биологии (например, путем изучения соответствующих РНК-последовательностей или белковых продуктов, синтезируемых генами метилированных и неметилированных участков хромосом) является актуальной.
Следует обратить внимание, что использование гистохимического метода детекции метилированных участков хромосом началось сравнительно недавно. До настоящего времени мало известно о чувствительности данного метода. Считается, что этим методом нельзя выявлять единичные метилированные CpG-островки в промоторах структурных генов [307]. Неясно, однако, при какой плотности метилированных цитозинов (CpG- островков) сигнал детекции становится положительным. Тем не менее, согласно уже полученным данным (см. главу 10) окраска метафазных хромосом из культивируемых лимфоцитов крови с применением антител к метилцитозину позволяет получить дифференциальную окраску, отличную от ранее хорошо известных G-, R-, Q-, C-, T-рисунков, получаемых стандартными методами. Данное обстоятельство позволяет говорить о наличии нового, специального метода дифференциальной окраски хромосом, который позволяет выявлять кластеры метилированной ДНК — М-сегментацию [71]. Известно также, что хромосомы дробящихся зародышей млекопитающих обнаруживают весьма характерную окраску, при которой типичные М-сегменты располагаются только в одной хроматиде (родительской) и отсутствуют в другой (дочерней) [307]. Такое расположение полос свидетельствует о задержке метилирования ДНК дочерних
хроматид на начальных стадиях развития. Гипометилирование одной из хроматид (гемиметилирование) отмечено нами и у доимплантационных зародышей человека. Другие важные находки при изучении паттернов метилирования хромосом дробящихся зародышей человека касаются наличия существенных различий в метилировании гомологичных хромосом и отсутствия метилирования крупных блоков гетерохроматина хромосом 1, 9, 16. В настоящее время имеются данные, что у дробящихся зародышей млекопитающих функционально активна почти половина всех структурных генов (около 15 000) [760]. Возможно, гипометилированное состояние генома как раз и отражает высокую транскрипционную активность генов ранних зародышей человека. Неожиданным следствием такого «раскрытия» хроматина у доимплантационных зародышей мышей, как показали молекулярные исследования, явилась массовая транскрипция эндогенных, то есть находящихся в составе ДНК хромосом и особенно широко представленных в гетерохроматине вирусоподобных последовательностей — ретротранспозонов. Более того, оказалось, что в ооцитах и у дробящихся зародышей происходит массовое перемещение ретротранспозонов по геному и их включение в промоторные области и даже в состав первых экзонов многих структурных генов [760]. Эти интересные факты дают основание рассматривать гипометилирование хроматина, транскрипцию и перемещение по геному ретротранспозонов, их интеграцию в структурные гены как цепь последовательных событий, необходимых для активации генома зародыша, формирования первичного эмбрионального транскриптома и начала реализации наследственной программы индивидуального развития.
Таким образом, деспирализации хромосом и гипометилированию ДНК принадлежит ключевая роль в запуске программы индивидуального развития. Эти принципиально важные наблюдения позволяют считать, что обнаруженные в наших исследованиях различия паттернов метилирования некоторых идентичных сегментов гомологичных хромосом, а также паттернов метилирования хромосом эмбриобласта и цитотрофобласта могут указывать на их большую роль в регуляции генной активности в раннем эмбриогенезе человека. Дальнейшее углубленное изучение этих новых цитогенетических феноменов с применением современных молекулярных и молекулярно-цитогенетических методов исследования представляет несомненный интерес для понимания особенностей функции генома на доимплантационных стадиях развития.
В заключение, уместно обратить внимание на то, что согласно разработанному и уже частично реализуемому в ряде лабораторий мира эпигеномному проекту предполагается новая программа по изучению общегеномного метилирования всех генов человека. В рамках этой программы уже составлен паттерн метилирования HLA-локуса, где картированы главные гены гистосовместимости. Ограничена ли эта программа только клетками различных тканей взрослого организма или будет включать паттерны метилирования генов в эмбриогенезе человека пока неясно.
Таким образом, несмотря на ранее отмеченные ограничения, дальнейший анализ паттернов метилирования метафазных хромосом в различных тканях зародыша и на разных стадиях развития является, безусловно, перспективным направлением цитогенетики (цитогеномики) эмбрионального развития человека.