В пренатальной диагностике наиболее широко используют хромосомный анализ клеток хориона и плаценты, получаемых под контролем ультразвука. Для массовых цитогенетических исследований особенно удобными являются «прямые» методы. Они экономичны, позволяют через несколько часов после проведения процедуры получить результат.
Предлагаемые варианты позволяют успешно (в 98,6 % случаев) проводить цитогенетическую пренатальную диагностику у беременных на сроках 9-24 недель беременности и адаптированы к условиям отечественных цитогенетических лабораторий.
Получение материала

1. Непосредственно в операционной биоптат из шприца перенести в чашку Петри (диаметром 100 мм) со средой Игла или Хенкса, (+30-37 °С). Среда должна содержать гепарин (25 000 ед.) и антибиотики пенициллин (50000 ед.) и стрептомицин (25 мг) — на 500 мл среды.
2. Отбор ворсин проводить под контролем бинокулярной лупы МБС-2 в проходящем свете затемненного поля. Отобранные ворсины и их фрагменты перенести в свежую порцию среды в чашку Петри (диаметром 40 мм) и визуально оценить количество полученного материала. Следующие этапы приготовления препаратов могут несколько отличаться.

1. «Прямой» метод

Протокол 1.4 (ускоренный «прямой» метод)

1. Отмытый от крови материал (по 5-10 мг) незамедлительно перенести в пенициллиновые флаконы с 5 мл 0,9%-го трехзамещенного безводного цитрата натрия и колхицином в конечной концентрации 2,5 мкг/мл. Гипотоническую обработку проводить при комнатной температуре 40-50 мин или при +37 °С 35-40 мин.
2. 2-3 мл гипотонического раствора удалить пипеткой. Во флакон порциями добавить примерно такой же объем холодного свежеприготовленного фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 3:1). Первую порцию фиксатора добавить по каплям, встряхивая флакон, затем струйно. Префиксацию проводить при комнатной температуре 45-90 мин. На этом этапе можно транспортировать полученный материал в лабораторию.
3. Весь префиксирующий раствор удалить пипеткой, остатки жидкости удалить фильтровальной бумагой. Во флакон с ворсинами налить 4-5 мл холодного (+4 °С) фиксатора. Фиксацию проводить 1-2 часа при 0-10 °С.
4. В чистый пенициллиновый флакон налить 3-4 мл свежего фиксатора, поместить в него ворсинку (2-3 мг) и добавить равный объем дистиллированной воды.
5. Через 2-5 мин, когда ворсина опустится на дно, вынуть ее пинцетом, обсушить фильтровальной бумагой и перенести на чистое обезжиренное предметное стекло, подогретое над пламенем спиртовки примерно до +45-50 °С, в каплю (0,3-0,5 мл) 60%-й уксусной кислоты. Мацерацию проводить под контролем бинокулярной лупы МБС-2, наблюдая за выходом клеток в проходящем свете затемненного поля и передвигая ворсину по стеклу препаровальной иглой.
6. Через 2-3 мин ворсину перенести на следующее предметное стекло в каплю уксусной кислоты, а полученную на первом стекле суспензию клеток покачиванием стекла распределить по поверхности. Избыток суспензии перенести на следующий препарат.
7. На препарат нанести 2-3 капли фиксатора и высушить над пламенем спиртовки или поджиганием фиксатора. Аналогично готовят следующие препараты.

Примечания

1. Митотический индекс не зависит от морфологии ворсины, поэтому не следует пренебрегать ворсинами, не имеющими выраженной васкуляризации.
2. Качество метафазных хромосом существенно зависит от гипотонической обработки, поэтому необходимо заблаговременно апробировать каждую новую партию цитрата натрия.
3. Гипотонический раствор, как и 60%-й раствор уксусной кислоты следует готовить в день использования.
4. Препараты следует готовить непосредственно в день забора материала, при увеличении срока хранения фиксированного материала значительно ухудшается их качество.
5. Из образца весом до 5 мг делать не более двух препаратов.

Протокол 1.5 (метод «стряхивания — отпечатывания» [184])
Пп. 1-5 см. Протокол 1.4.
6. Несколько раз приподнять мацерированную ворсинку в капле размягчающей смеси, т. е. провести «стряхивание» клеток и сделать этой ворсинкой серию отпечатков на стекле. Перенести ворсинку на следующее предметное стекло в каплю уксусной кислоты и повторить манипуляции.

7. См. п. 7 Протокола 1.4.

2. Кратковременное культивирование («полупрямой» метод) Протокол 1.6

1. Биоптаты поместить в пенициллиновые флаконы с 5 мл культуральной среды и инкубировать 1-2 или 24 часа в термостате с 5 % СО2 или в замкнутой системе при +37 °С. В случае 24-часовой инкубации в среду добавить 0,5-1 мл эмбриональной телячьей сыворотки.
2. За 30-50 мин до фиксации ввести колхицин в конечной концентрации 0,5-1 мкг/мл.
3. Заменить культуральную среду на 5 мл 0,9%-го цитрата натрия и проводить гипотоническую обработку в течение 15 — 20 мин.
4. Остальные этапы соответствуют пп. 2-6 Протокола 1.4.

Примечания

1. Удается повысить митотический индекс, поместив ворсины хориона в культуральной среде на 6-12 часов в холодильник (+4 °С), а затем перенести в термостат (+37 °С).
2. Нецелесообразно инкубировать мелкие фрагменты ворсинок. Образец для культивирования должен быть не менее 8-10 мг.
3. Инкубирование не улучшает качество метафазных хромосом для традиционных методов дифференциальной окраски. Целесообразно использовать этот метод для получения репликационного рисунка дифференциальной окраски.