Возможно двумя методами: рестрикцией с последующей ник- трансляцией in situ или прямой детекцией 5-метилцитозина с помощью специфичных антител.

1. Ник-трансляция in situ

1. Рестрикция

В качестве предобработок перед ник-трансляцией инкубировать препараты метафазных хромосом с эндонуклеазами рестрикции MspI и HpaII. Рестриктазы являются изошизомерами и вносят разрывы в последовательности C^CGG, при этом HpaII в отличие от MspI расщепляет сайт, если внутренний цитозин не метилирован.
Протокол 6.2

1. Провести обработку препаратов рестриктазами во влажной камере при 37 °С в течение 45 мин. Под покровные стекла 22x50 нанести инкубационную смесь, состоящую из 50 мкл буферного раствора для MspI (Promega) или HpaII (Promega) и фермента в концентрации 0,25 ед/мкл.
2. Препараты отмыть в1xPBS с 0,5 М ЭДТА 5-10 минут, затем в 1x PBS и высушить на воздухе.

2. Реакция ник-трансляции in situ [143]

Протокол 6.3

1. На препараты под покровные стекла 22x50 нанести по 60 мкл бу- ферадля ник-трансляции, содержащий 10 мМ ДТТ, 0,5 М Tris-HCl (pH 7,6), 50 мМ MgCl, Dig-11-dUTP (20 мкмоль) (Boehringer Mannheim), дАТФ, дГТФ, дЦТФ (по 20 мкмоль каждого), дТТФ (5 мкмоль) (СибЭнзим), ДНК-полимеразу I (0,01 ед/мкл), свободную от ДНКазной активности (Boehringer Mannheim), и инкубировать при 17 °С в течение 40 мин.
2. Отмыть препараты в 5%-й трихлоруксусной кислоте при 4 °С 1 мин.
3. Отмыть в специальном буферном растворе (1 М Tris-HCl, 4 М NaCl, 2,5 М MgCl2) в течение 10 мин и в 1xPBS 5 мин.
4. Ополоснуть в дистиллированной воде и, не высушивая, нанести блокирующий раствор (Boehringer Mannheim) на 1xBPS и инкубировать 30 мин при 37 °С.
5. Детекцию дигоксигенина провести с использованием антиди- гоксигенин-флюоросцеина в концентрации 80 мкг/мл (Boehringer Mannheim) 60 мин при 37 °С.
6. Отмыть в трех сменах 1xPBS c 0,1 % Tween-20, ополоснуть в дистиллированной воде и высушить на воздухе. Препараты заключить в фотозащитный раствор, содержащий DABCO и красители ДАПИ (1 мкг/мл) и пропидиум йодид (0,5 мкг/мл).

Примечание
Для контроля специфичности реакции используют препараты:
а)              инкубированные в буферном растворе без ферментов MspI или HpaII с последующей ник-трансляцией и детекцией ник-трансляцион- ного сигнала;
б)              инкубированные в буферном растворе для ник-трансляции без ДНК-полимеразы I, после предварительной обработки хромосом ферментами и последующей детекцией ник-трансляционного сигнала.
6.2.1.З.              Анализ препаратов
Включение dig-11-UTP регистрируют по распределению флуоресцентных сигналов. Идентификацию хромосом проводят с помощью дифференциального окрашивания DAPI.
Анализ препаратов проводят на универсальных микроскопах, например:

1. ЛЮМАМ РПО 11 (ЛОМО), оборудованном объективами СХ 20x/0,45 и М-флюар 100x/1,30, тубусной оптикой с линзами от 1,1х до 1,6х, черно-белой CCD-камерой накопления сигнала (Chiper);
2. DMRXA (Leica), оборудованном объективами FLUOTAR 40x/0,70 и 100x/1,30, автоматической фотонасадкой, черно-белой CCD-камерой накопления сигнала (Cohu) в проходящем свете и с помощью блока светофильтров для флуорохромов FITC, DAPI и йодистого пропидия.

2. Иммунофлуоресцентный метод детекции 5-метилцитозина на препаратах метафазных хромосом с помощью моноклональных антител

Протокол 6.4 [71]

1. Препараты метафазных хромосом денатурировать в растворе 2 М HCl в течение 25-30 мин при комнатной температуре.
2. Провести через ледяной 1xPBS (рН 7,2-7,4), две смены 1xPBS (pH 7,2-7,4) и две смены дистиллированной воды (по 2 мин) при комнатной температуре и высушить на воздухе.
3. На препараты нанести по 100 мкл блокирующего раствора (Boehringer Mannhiem) на 1xPBS (pH 7,2-7,4) (под покровное стекло 24x60) и инкубировать 40 мин во влажной камере при температуре +37 °С.
4. На влажные препараты под покровные стекла 24x60 нанести по 100 мкл раствора моноклональных антител к 5-метилцитозину (Eurogentec), разведенных в блокирующем растворе (Boehringer Mannhiem) в соотношении 1:500, и инкубировать 60 мин во влажной камере при комнатной температуре в отсутствии света.
5. Препараты отмыть в трех сменах 1xPBS (pH 7,2-7,4), содержащего 0,5 % Tween 20, по 3 мин в каждой, на водяной бане при температуре 43 °С.
6. На влажные предметные стекла нанести раствор моноклональных антител, конъюгированные с FITC (anti-mouse FITC, Sigma), разведенных в блокирующем растворе (Boehringer Mannhiem) в соотношении 1:50 (под покровное стекло 24x60), и инкубировать 60 мин во влажной камере при температуре +37 °С.
7. Препараты отмыть в трех сменах 1xPBS (pH 7,2-7,4), содержащего 0,5 % Tween 20, по 3 мин в каждой, на водяной бане при температуре 43 °С.
8. Препараты ополоснуть в 1xPBS (pH 7,2-7,4) и дистиллированной воде, провести через серию спиртов 70°, 80°, 96° при комнатной температуре и высушить на воздухе.
9. Препараты заключить под покровные стекла 24x60 в фотозащитный раствор, содержащий DABCO, красители пропидиум йодид и DAPI в концентрации 1мкг/мл.

1. Анализ препаратов

Связывание антител регистрируют по распределению флуоресцентных сигналов.
Анализ препаратов проводят c помощью микроскопа DMLS (Leica), оборудованного объективами FLUOTAR 20x/0,40 и 100x/1,30-0,60, автоматической фотонасадкой, цветной камерой Leica DFC 320, блоком светофильтров для флуорохромов FITC, DAPI и йодистого пропидия. Для получения видеоизображения используют программное обеспечение Leica DFC Twain. Для анализа видеоизображения используют программное обеспечение Adobe Photoshop 7.0.