АНАЛИТИЧЕСКАЯ И ПРЕПАРАТИВНАЯ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЯ

  Метод проточной цитофлуориметрии, предложенный в начале 1970-х годов, широко используется в медико-биологических и клинических исследованиях. Востребованность цитометрии объясняется быстротой, точностью и надежностью метода. Определение фенотипа каждой клетки в сочетании с анализом большого количества событий дает максимально полную информацию в кратчайшие сроки.
Принцип метода. Используются проточные цитометры разных фирм. При проведении исследования клетки, окрашенные тем или иным флуоресцентным красителем, вводят с потоком буферного раствора в вибрирующую проточную камеру с форсункой. В каждой капле жидкости, выходящей из форсунки, содержится одна клетка. Источник света (чаще всего лазер) освещает отдельные клетки в проходящей через световой пучок тонкой струе жидкости. Исходный световой луч рассеивается клеткой. Это рассеяние измеряется с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Рассеяние света под малыми углами (переднее рассеяние — forward scatter) может быть использовано для определения размеров клетки. На основе данного параме
тра можно отличить жизнеспособные ядерные клетки от мертвых и эритроцитов. Рассеяние света под углом 90° (боковое рассеяние — side scatter) позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы и наличии гранул в клетке. Полученные характеристики позволяют разделить анализируемые лейкоциты на лимфоциты, моноциты, нейтрофилы. Одновременно можно проводить анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов клеток с помощью моноклональных антител к ним, конъюгированных с различными флуоресцентными метками. Если анализируемая клетка содержит флуорохром, то он испускает излучение соответствующих параметров, при этом интенсивность флуоресценции коррелирует с плотностью антигена на клеточной поверхности, а уровень флуоресценции измеряется с помощью ФЭУ (рис. 2.4, см. также цв. вклейку).
В практике широко используются два флуоресцентных красителя — флуоресцеин-5-изотиоционат (ФИТЦ) и R-фикоэритрин (ФЭ). Они возбуждаются аргоновым лазером с длиной волны 488 нм и излучают флуоресценцию в разных диапазонах волн: ФИТЦ излучает свет в «зеленом» спектре, а ФЭ — в «оранжево-красном». Красители различаются как по специфичности их молекулярного связывания, так и по оптическим характеристикам, таким, как спектр поглощения, возбуждение флуоресценции и др. В настоящее время спектр используемых флуорохромов расширился (табл. 2.1).
Таблица 2.1. Основные используемые флуорохромы

No

Название
флуорохрома

Цвет испускаемой флуоресценции

Длина волны лазеров, нм

Спектр излучения, нм

1

Alexa Fluor 405

Синий

360, 405, 407

421

2

Pacific Blue

Голубой

360, 405, 407

455

3

AmCyan

Зеленый

405, 407

491

4

Alexa Fluor 488

Зеленый

488

519

5

FITC

Зеленый

488

519

6

PE

Желтый

488, 532

578

7

PE-Texas Red

Оранжевый

488, 532

615

Окончание табл. 2.1


Название
флуорохрома

Цвет испускаемой флуоресценции

Длина волны лазеров, нм

Спектр излучения, нм

8

Texas Red

Оранжевый

595

615

9

АРС

Красный

595,633, 635, 647

660

10

Alexa Fluor 647

Красный

595, 633, 635, 647

668

11

РЕ-Су5

Красный

488, 532

667

12

PerCP

Красный

488,532

678

13

PerCP-Cy5.5

Насыщенный
красный

488, 532

695

14

Alexa Fluor 700

Насыщенный
красный

633, 635

719

15

PE-Cy7

Инфракрасный

488, 532

785

16

APC-Cy7

Инфракрасный

595, 633, 635, 647

785

17

BD АРС-Н7

Инфракрасный

595, 633, 635, 647

785

Флуорохромы, связывающиеся с ДНК

Бромистый этидий


518

610

Пропидиум иодид


540

625

Проточный цитометр включает три основных блока:
  1. оптический, где производится измерение;
  2. блок обработки сигналов, где сигналы усиливаются и преобразуются в электрические;
  3. блок сбора и обработки данных (см. рис. 2.4).

Оптические системы
Источником света обычно служит лазер. Он способен направить на клетку интенсивный световой сигнал и создать чувствительную систему детекции.
Световой сигнал проходит через соответствующие линзы и зеркала и попадает на ФЭУ. На этой стадии передачи сигнала используются
оптические фильтры для выделения света с определенной длиной волны, благодаря чему на каждый детектор попадает только избранный тип светового сигнала, например зеленое или красное излучение клеток при флуоресценции или рассеянный свет. Оптический блок предназначен для измерения рассеяния света и флуоресценции. Современные цитометры оборудованы несколькими фотоэлектронными умножителями, что позволяет одновременно регистрировать несколько типов флуоресценции.

Рис. 2.4. Устройство проточного цитометра

Источник: под ред. Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской., «Иммунология : практикум : учеб, пособие» 2010

А так же в разделе «АНАЛИТИЧЕСКАЯ И ПРЕПАРАТИВНАЯ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЯ »