предыдущая
к содержанию
следующая

  Лабораторная работа 2-2 Постановка метода Рекалде 

  1. Кровь осторожно перемешивают с 6% раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция), приготовленном на физиологическом растворе из расчета: 1 объем декстрана на 5 объемов крови.
  2. Кровь отстаивается в течение 30 мин (15 мин при 37 °С, затем 15 мин при комнатной температуре).
  3. Осторожно собирают плазму, обогащенную лейкоцитами (лей- комасса). К полученной лейкомассе трехкратно добавляют раствор NaCl по следующей схеме:
  • 0 мин — добавляют 9% NaCl из расчета 5 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С;
  • 11-я минута — добавляют 9% NaCl из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37° С;
  • 21-я минута — добавляют 9% NaCl из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С.

Общее время инкубации составляет 30 мин.
  1. К лейкомассе добавляют равный объем раствора Хенкса, соответствующей осмомолярности, полученный путем добавления 25 мкл 9% раствора NaCl на каждый миллилитр стандартного раствора Хенкса.
  2. Немедленно проводят выделение моноцитов на гипертоническом градиенте плотности. Для этого в стандартный раствор фиколл- урографина добавляют кристаллический NaCl из расчета 2,8 мг на каждый миллилитр раствора фиколл-урографина (удельная плотность 1,078 г/см3). Конечная плотность раствора составляет 1,080 г/см3. В силиконированные пробирки на один объем гипертонического градиента осторожно наслаивают 3 объема подготовленной лейкомассы.
  3. Пробирки центрифугируют в течение 25 мин при 400 g при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования моноциты концентрируются в интерфазном кольце.
  4. Моноциты из интерфазы переносят в силиконированные пробирки и дважды отмывают средой 199, содержащей 5% СЭК. Режим центрифугирования — 10 мин при 200 g.
  5. Клетки ресуспендируют в питательной среде RPMI-1640, содержащей 1% L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина и 10% СЭК. Количество моноцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивают с помощью 0,1% раствора три- панового синего. 
предыдущая
к содержанию
следующая

Источник: под ред. Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской., «Иммунология : практикум : учеб, пособие» 2010

А так же в разделе «  Лабораторная работа 2-2 Постановка метода Рекалде  »