Недостатки метода ДНК-фингерпринта.
Одним из недостатков метода ДНК-фингерпринта является необходимость в сравнительно большом количестве биоматериала. Трупные ткани - около 1 г, жидкая кровь - около 5 мл. Пятна крови или спермы - диаметр пятна не менее 3 см.
(влажный жаркий климат), условия хранения биообъектов.
Образцы крови и спермы от живых лиц необходимо немедленно высушивать на марлевой салфетке, защитив от солнца (но не на батарее водяного отопления). Хранение спермы в жидком виде недопустимо.
В целом, применение метода ДНК-фингерпринта наиболее эффективно в первые 3-4 месяца образования пятен спермы и 6-8 месяцев образования пятен крови ("Методические рекомендации” ЭКЦ МВД России). Трупные ткани с резко выраженными гнилостными изменениями для исследования не пригодны. Если проведение исследования заведомо бесперспективно, то следует от него отказаться в целях сохранения материала для исследования другими методами.
Методом ДНК-фингерпринта невозможно исследовать пятна крови или спермы полученные от нескольких лиц одновременно. ДНК с обильным бактериальным загрязнением непригодна для исследования.
Указанные проблемы были с успехом решены после появления типирования ВТП методом ферментативной амплификации ДНК, т.е. умножения ДНК, основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Открыл этот метод в 1985 г. сотрудник химической корпорации "Це- тус" (США) К.Мюллис. За это открытие он был удостоен Императорской премии Японии. Сам он считает себя "универсалом со склонностью к химии". Будучи аспирантом Калифорнийского университета, он опубликовал статью "Космологическое значение обратного времени". Мюллис имеет учёную степень доктора философии в области биохимии.
Идея метода и его воплощение, на первый взгляд, просты. Основа метода в том, что в микропробирках, используя специальные аппараты - программируемые термоциклеры и реагенты, можно получить миллионы копий интересующих участков ДНК.
Реакция амплификации идет циклично. Каждый цикл включает в себя три фазы.
Первая фаза - денатурация матричной (исследуемой) ДНК при температуре свыше 94° C, при этом происходит разделение цепей ДНК.
Вторая фаза - так называемый отжиг праймеров с родственными по структуре, т.е. гомологичными участками ДНК-матрицы при температуре 45-65° C. Праймер еще называют затравкой, т.к. он инициирует начало синтеза цепи ДНК. Причем, на каждой из цепей матрицы, праймеры, а они представляют собой синтетическую короткую - 20-30 п.н. (нуклеотидов) молекулу ДНК, располагаются в направлении "навстречу друг к другу".
Третья фаза - достраивание второй цепи ДНК при участии ДНК-полимеразы и смеси четырех оснований (аденозина, гуанина, цитозина и тимина). Синтез идет между двумя праймерами при температуре 70-72° C.
Последовательность трех перечисленных фаз реакций (циклов) повторяют 30-35 раз. В результате чего, уже после второго цикла появляются фрагменты ДНК, являющиеся копией участков матричной ДНК, ограниченные по краям праймерами. Эти копии, в свою очередь, служат матрицей для последующих реакций, т.е. процесс является цепным. Количество синтезируемой ДНК увеличивается в геометрической прогрессии. При соблюдении оптимальных условий можно добиться увеличения количества каждой молекулы ДНК кратного миллиону. Это позволяет, после электрофоретического разделения, провести их визуальный анализ, с помощью маркера молекулярных масс оценить размеры и, на основе среднестатистических данных о частоте встречаемости аллелей данного локуса ДНК в популяции, рассчитать вероятность случайного их совпадения.
Мюллис сравнивает ПЦР с молекулярным амплификатором, который усиливает звук взмаха крыльев бабочки до рева мощного реактивного двигателя.
Метод ПЦР позволяет использовать в качестве стартовой матрицы ничтожно малое количество ДНК, причем с высокой степенью деградации, загрязненной бактериями, плесенью, а так же смесь ДНК от нескольких лиц, полученную из крови, спермы, а также из трупного материала, волос, костей, тампонов с содержимым полостей тела. В последнем случае, при исследовании тампонов с содержимым влагалища, ДНК получают используя методику дифференциального лизиса. Это позволяет отделить ДНК из спермы от ДНК сопутствующих клеток женского происхождения. Использование в исследовании образцов ДНК самой женщины гарантирует от ошибки. Принадлежность ДНК мужчине доказывается амплификацией участков У-хро- мосомы.
Метод ПЦР состоит только из трех этапов: получение ДНК, собственно ПЦР и электрофоретический анализ продуктов реакции в полиакриламидном геле с последующим фотодокументированием геля.
Примерный перечень ситуаций в следственной практике, при которых наиболее перспективно использование методов генотипиро- вания:
Приведём несколько случаев из практики нашего отделения.
В пригороде Санкт-Петербурга было совершено изнасилование гр. К. В совершении преступления подозревалось пять человек. Все подозреваемые имели одну и ту же группу крови. Но, в результате исследования ДНК, полученной из пятен спермы на одежде, была доказана причастность двоих из них к этому преступлению.
В пруду по дороге на п.Каменка обнаружен труп неизвестного. По данным следствия стало известно, что погибшим может являться гр.А. Однако, из-за длительного нахождения трупа в воде, родственниками опознан не был. Экспертами было установлено кровное родство между убитым и его предполагаемыми матерью и отцом. Таким образом, была проведена генетическая идентификация неизвестного трупа.
В мусорном контейнере на территории Санкт-Петербурга был обнаружен труп новорожденной с признаками насильственной смерти. В совершении детоубийства подозревалась гр. С. Категорическое исключение этого материнства ускорило розыск настоящей матери, повинной в убийстве своего ребёнка.
Гр.Р. обвинялся в убийстве своей матери с последующим расчленением. Голова трупа найдена не была. Обвиняемый выдвинул версию, что убитая не является его матерью. После исследования образцов ДНК, материнство было доказано.
В нашей практике длительность экспертизы составляет в среднем 2-3 недели. Однако, использование зарубежных экспресс-систем для получения ДНК, наличие достаточного парка термоциклеров и мощных комплексов для электрофореза с одновременным сканированием и компьютерной обработкой результатов, позволяет выполнить экспертизу за 3-5 дней.
Недостатком ПЦР является чувствительность к ингибиторам реакции, которые могут входить в состав предмета-носителя. Но, использование диализных мембран или специальных сорбентов зачастую позволяет избавить раствор ДНК от таких веществ.
Для расчета вероятности случайного совпадения аллелей в Судебно-медицинской экспертной службе Санкт-Петербурга используют метод, предложенный Чакраборти и др. (Am.J. Hum. Genet. - V.52. - 1993).
При этом, даже после исследования только трех общепринятых локусов генома (Аро В, Д^ 80, ДI7S30) и выявлении аллелей с наибольшей частотой встречаемости, вероятность ошибки будет не более 0,4%. При исследовании большего числа локусов вероятность ошибки снижается на 2-3 порядка. Таким образом, достоверность идентификации практически приближается к 100%.
Возможные погрешности метода.
Недостаточное разделение фрагментов ДНК при электрофорезе, искривление фронта их движения, отсутствие необходимого маркера молекулярных масс может привести к ошибочной оценке результатов. Нарушение режима амплификации, оптимального соотношения реагентов реакционной смеси может повлечь за собой отсутствие амплификации аллелей присущих данному генотипу, или появление аллелей несвойственных ему. Ошибки могут так же возникнуть при вычислении степени вероятности установления личности, когда при расчетах используют частоту встречаемости того или иного аллелея, которая не свойственна популяции данного региона.
Однако, квалифицированное проведение исследования, использование только качественных реактивов, высокоточных термоциклеров, а так же применение известных методов контроля (положительного, отрицательного, контроля внутренних загрязнений и др), позволяет свести ошибку к минимуму.
Основной критерий в соотношении серологических и генетических методов исследования - здравый смысл.
Стоимость полного исследования одного образца ДНК за рубежом оценивается в 90-100 долларов США. Поэтому, совершенно необходимо предварительное исследование пятен на предмет наличия крови или спермы человека, а также трупного материала сомнительного видового происхождения с помощью серологических методов.
В тех случаях, когда судебно-следственными органами представлены образцы крови от нескольких подозреваемых, необходимо их предварительное разграничение с помощью серологических методов. Выполнение этого требования возможно только при достаточном количестве биоматериала в представленных объектах, и вопрос о тактике проведения экспертизы решается судебно-медицинскими экспертами двух подразделений коллегиально.
- Высокие требования к сохранности ДНК в биоматериала. Из-за своей морфологии, а это - длинная и тонкая нить, молекула ДНК столь хрупка, что даже при выделении ее из ядер клеток она легко разрушается. Но разрывы ДНК возникают не только под воздействием механических факторов, но и под воздействием химических факторов - кислоты, щелочи; физических факторов - нагревание, действие прямых солнечных лучей; биологических факторов - действие различных ферментов, бактерий, плесневых грибов, а так же ферментов, образующихся в результате гниения самих биообъектов.
- Сроки давности следов так же имеют существенное значение. Правда, устойчивость ДНК во внешней среде трудно ограничить строгими временными рамками. Она определяется составом биологического субстрата, с которым соприкасается. Имеет значение и характер предмета-носителя (синтетические ткани, джинсовая ткань), скорость высушивания пятна, воздействие факторов внешней среды
(влажный жаркий климат), условия хранения биообъектов.
Образцы крови и спермы от живых лиц необходимо немедленно высушивать на марлевой салфетке, защитив от солнца (но не на батарее водяного отопления). Хранение спермы в жидком виде недопустимо.
В целом, применение метода ДНК-фингерпринта наиболее эффективно в первые 3-4 месяца образования пятен спермы и 6-8 месяцев образования пятен крови ("Методические рекомендации” ЭКЦ МВД России). Трупные ткани с резко выраженными гнилостными изменениями для исследования не пригодны. Если проведение исследования заведомо бесперспективно, то следует от него отказаться в целях сохранения материала для исследования другими методами.
Методом ДНК-фингерпринта невозможно исследовать пятна крови или спермы полученные от нескольких лиц одновременно. ДНК с обильным бактериальным загрязнением непригодна для исследования.
Указанные проблемы были с успехом решены после появления типирования ВТП методом ферментативной амплификации ДНК, т.е. умножения ДНК, основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Открыл этот метод в 1985 г. сотрудник химической корпорации "Це- тус" (США) К.Мюллис. За это открытие он был удостоен Императорской премии Японии. Сам он считает себя "универсалом со склонностью к химии". Будучи аспирантом Калифорнийского университета, он опубликовал статью "Космологическое значение обратного времени". Мюллис имеет учёную степень доктора философии в области биохимии.
Идея метода и его воплощение, на первый взгляд, просты. Основа метода в том, что в микропробирках, используя специальные аппараты - программируемые термоциклеры и реагенты, можно получить миллионы копий интересующих участков ДНК.
Реакция амплификации идет циклично. Каждый цикл включает в себя три фазы.
Первая фаза - денатурация матричной (исследуемой) ДНК при температуре свыше 94° C, при этом происходит разделение цепей ДНК.
Вторая фаза - так называемый отжиг праймеров с родственными по структуре, т.е. гомологичными участками ДНК-матрицы при температуре 45-65° C. Праймер еще называют затравкой, т.к. он инициирует начало синтеза цепи ДНК. Причем, на каждой из цепей матрицы, праймеры, а они представляют собой синтетическую короткую - 20-30 п.н. (нуклеотидов) молекулу ДНК, располагаются в направлении "навстречу друг к другу".
Третья фаза - достраивание второй цепи ДНК при участии ДНК-полимеразы и смеси четырех оснований (аденозина, гуанина, цитозина и тимина). Синтез идет между двумя праймерами при температуре 70-72° C.
Последовательность трех перечисленных фаз реакций (циклов) повторяют 30-35 раз. В результате чего, уже после второго цикла появляются фрагменты ДНК, являющиеся копией участков матричной ДНК, ограниченные по краям праймерами. Эти копии, в свою очередь, служат матрицей для последующих реакций, т.е. процесс является цепным. Количество синтезируемой ДНК увеличивается в геометрической прогрессии. При соблюдении оптимальных условий можно добиться увеличения количества каждой молекулы ДНК кратного миллиону. Это позволяет, после электрофоретического разделения, провести их визуальный анализ, с помощью маркера молекулярных масс оценить размеры и, на основе среднестатистических данных о частоте встречаемости аллелей данного локуса ДНК в популяции, рассчитать вероятность случайного их совпадения.
Мюллис сравнивает ПЦР с молекулярным амплификатором, который усиливает звук взмаха крыльев бабочки до рева мощного реактивного двигателя.
Метод ПЦР позволяет использовать в качестве стартовой матрицы ничтожно малое количество ДНК, причем с высокой степенью деградации, загрязненной бактериями, плесенью, а так же смесь ДНК от нескольких лиц, полученную из крови, спермы, а также из трупного материала, волос, костей, тампонов с содержимым полостей тела. В последнем случае, при исследовании тампонов с содержимым влагалища, ДНК получают используя методику дифференциального лизиса. Это позволяет отделить ДНК из спермы от ДНК сопутствующих клеток женского происхождения. Использование в исследовании образцов ДНК самой женщины гарантирует от ошибки. Принадлежность ДНК мужчине доказывается амплификацией участков У-хро- мосомы.
Метод ПЦР состоит только из трех этапов: получение ДНК, собственно ПЦР и электрофоретический анализ продуктов реакции в полиакриламидном геле с последующим фотодокументированием геля.
Примерный перечень ситуаций в следственной практике, при которых наиболее перспективно использование методов генотипиро- вания:
- Идентификация личности по следам биологического происхождения, оставленным на месте преступления.
- Установление кровного родства при: детоубийстве, кидне- пинге, подмене детей в роддоме; спорном отцовстве; в делах о наследовании; идентификации неизвестных трупов (установление посмертного кровного родства); установлении отцовства, наступившего после изнасилования, по остаткам плодного яйца после аборта.
- Установление принадлежности частей трупов одному или нескольким лицам в случае расчленения.
- Установление половой принадлежности частей тела, пятен крови, волос.
Приведём несколько случаев из практики нашего отделения.
В пригороде Санкт-Петербурга было совершено изнасилование гр. К. В совершении преступления подозревалось пять человек. Все подозреваемые имели одну и ту же группу крови. Но, в результате исследования ДНК, полученной из пятен спермы на одежде, была доказана причастность двоих из них к этому преступлению.
В пруду по дороге на п.Каменка обнаружен труп неизвестного. По данным следствия стало известно, что погибшим может являться гр.А. Однако, из-за длительного нахождения трупа в воде, родственниками опознан не был. Экспертами было установлено кровное родство между убитым и его предполагаемыми матерью и отцом. Таким образом, была проведена генетическая идентификация неизвестного трупа.
В мусорном контейнере на территории Санкт-Петербурга был обнаружен труп новорожденной с признаками насильственной смерти. В совершении детоубийства подозревалась гр. С. Категорическое исключение этого материнства ускорило розыск настоящей матери, повинной в убийстве своего ребёнка.
Гр.Р. обвинялся в убийстве своей матери с последующим расчленением. Голова трупа найдена не была. Обвиняемый выдвинул версию, что убитая не является его матерью. После исследования образцов ДНК, материнство было доказано.
В нашей практике длительность экспертизы составляет в среднем 2-3 недели. Однако, использование зарубежных экспресс-систем для получения ДНК, наличие достаточного парка термоциклеров и мощных комплексов для электрофореза с одновременным сканированием и компьютерной обработкой результатов, позволяет выполнить экспертизу за 3-5 дней.
Недостатком ПЦР является чувствительность к ингибиторам реакции, которые могут входить в состав предмета-носителя. Но, использование диализных мембран или специальных сорбентов зачастую позволяет избавить раствор ДНК от таких веществ.
Для расчета вероятности случайного совпадения аллелей в Судебно-медицинской экспертной службе Санкт-Петербурга используют метод, предложенный Чакраборти и др. (Am.J. Hum. Genet. - V.52. - 1993).
При этом, даже после исследования только трех общепринятых локусов генома (Аро В, Д^ 80, ДI7S30) и выявлении аллелей с наибольшей частотой встречаемости, вероятность ошибки будет не более 0,4%. При исследовании большего числа локусов вероятность ошибки снижается на 2-3 порядка. Таким образом, достоверность идентификации практически приближается к 100%.
Возможные погрешности метода.
Недостаточное разделение фрагментов ДНК при электрофорезе, искривление фронта их движения, отсутствие необходимого маркера молекулярных масс может привести к ошибочной оценке результатов. Нарушение режима амплификации, оптимального соотношения реагентов реакционной смеси может повлечь за собой отсутствие амплификации аллелей присущих данному генотипу, или появление аллелей несвойственных ему. Ошибки могут так же возникнуть при вычислении степени вероятности установления личности, когда при расчетах используют частоту встречаемости того или иного аллелея, которая не свойственна популяции данного региона.
Однако, квалифицированное проведение исследования, использование только качественных реактивов, высокоточных термоциклеров, а так же применение известных методов контроля (положительного, отрицательного, контроля внутренних загрязнений и др), позволяет свести ошибку к минимуму.
Основной критерий в соотношении серологических и генетических методов исследования - здравый смысл.
Стоимость полного исследования одного образца ДНК за рубежом оценивается в 90-100 долларов США. Поэтому, совершенно необходимо предварительное исследование пятен на предмет наличия крови или спермы человека, а также трупного материала сомнительного видового происхождения с помощью серологических методов.
В тех случаях, когда судебно-следственными органами представлены образцы крови от нескольких подозреваемых, необходимо их предварительное разграничение с помощью серологических методов. Выполнение этого требования возможно только при достаточном количестве биоматериала в представленных объектах, и вопрос о тактике проведения экспертизы решается судебно-медицинскими экспертами двух подразделений коллегиально.