БАВ ИГЛОКОЖИХ
Как и среди гидробионтов других типов, изученных на наличие БАВ, морские организмы, относящиеся к иглокожим, составляют лишь незначительную часть общего их количества. И тем не менее уже полученные результаты исследования позволяют надеяться на несомненную значимость для современного лекарствоведения гидробионтов типа иглокожих в качестве источника многих интересных субстанций, в том числе и характеризующихся антимитозным действием. В этом отношении наибо-
13 Зак. 889
лее перспективным представляется класс морских огурцов — Holothuroidea — четвертый класс иглокожих. Вообще иглокожие, являющиеся весьма своеобразной группой морских животных, подразделяются на 5 больших классов: морские звезды — Asteroidea (I). змеехвостки —Ophiureidea (II), морские ежи — Echinoidea (III), морские огурцы (голотурии) — Holothuroidea (IV), морские лилии — Crinoidea (V).
Иглокожие водятся исключительно в морях, причем обитают на любой доступной глубине. Они ведут придонный образ жизни, передвигаются по грунту. Их основная пища — животные организмы, в том числе рыбы. Сами иглокожие поедаются различными морскими организмами, например треской. В пределах территориальных вод Советского Союза наибольшие скопления иглокожих отмечаются в морях Тихого и Северного Ледовитого океанов, меньше — в Черном и Балтийском морях и совсем их нет в Каспийском море. Из перечисленных классов иглокожих наиболее обследованными являются морские звезды и особенно голотурии. Голотурии, напоминающие при сокращении своего мешковидного тела свежие огурцы, достигают больших размеров—до 2 метров и более, хотя большинство видов, а их насчитывается около 900, характеризуется более скормными размерами— 10—40 см. Это малоподвижные животные, еле передвигающиеся обычно по дну в поисках животной пищи. Отдельные виды голотурий обладают оригинальным приспособлением, очевидно, имеющим защитное назначение: специальным железистым аппаратом — кювьеровыми органами. При опасности голотурии выбрасывают кювьеровы органы, содержащие клейкую, густоватую, высоко токсичную жидкость, через иголку наружу, прямо на видимого противника. Многие виды морских огурцов (около 40) употребляются человеком в пищу под названием трепангов.
Наиболее известными голотуриями, встречающимися в территориальных водах нашей страны, являются японский промысловый морской огурец Cucumaria japonica и промысловая голотурия (дальневосточный трепанг) Stichopus japonicus. Первый вид — Cucumaria japonica —- в огромном количестве встречается в Японском, Охотском и Беринговом морях и'вылавливается донными тралами (до 12—15 ц за одно траление). Stichopus japonicus имеет промысловое значение и подвергается отлову и заготовке. Многие из изученных видов морских звезд и голотурий продуцируют высокотоксичные соединения, экологическое значение которых обычно связывают с процессом борьбы за существование. О наличии ядовитых веществ в организме морских звезд и голотурий сообщалось еще в 1886 г. (Halstead, 1965). Однако серьезное внимание БАВ этих классов привлекли к себе после работ Nigrelli, открывшего среди них стероидные сапонины с выраженным цитостатическим эффектом. По существу, описанный в начале 50-х годов нашего
столетия стероидный сапонин голотурии, выделенный Nigrelli из багамской голотурии Actinopyga agassizi, явился первым сапонином животного происхождения. В последующие годы БАБ гликозидной природы были извлечены из нескольких десятков видов морских огурцов и звезд. В большинстве своем выделенные БАБ имели в основном стероидный углеродный скелет с различными боковыми цепями. Наибольший интерес исследователей привлекли к себе описанные многими авторами стероидные сапонины, объединенные общим термином —голотурии.
Под названием «голотурии» были изолированы БАВ из Но- lothuria vagabunda еще в начале 40-х годов. Тем не менее интенсивное изучение токсинов морских огурцов началось только после опубликования результатов экспериментов Nigrelli (1952) об ингибирующем действии БАВ, полученного им из экстрактов тканей Actinopyga agassizi в отношении роста саркомы-180 у мышей. Следует отметить, что несколько ранее появились сообщения о выраженном угнетении клеточного деления вытяжек из различных тканей морских организмов, в частности из моллюсков и морских звезд (Heilbrunn et al., 1951). Авторы указывали, что как водные, так и водно-спиртовые вытяжки из гидробионтов и особенно морских звезд обладают сильным антимитозным действием за счет влияния на синтез белковых макромолекул и коллоидную структуру протоплазмы клеток, и высказали предположение о несомненной перспективности поиска цитостатических и антимитозных веществ среди БАВ гидробионтов. В этих условиях появление краткого, всего на одну страницу, сообщения вызвало особенный интерес к БАВ, продуцируемых голотуриями. В своих опытах Nigrelli использовал водный раствор комплекса БАВ, содержащихся в кювьеровых органах. Это был очень простой галеновый препарат БАВ голотурии. Однако опыты в связи с определением биологической активности этого галенового препарата вызвали большой резонанс и имели далеко идущие последствия для перспективного поиска новых цитостатиков среди БАВ морских организмов. В своем первом эксперименте Nigrelli (1952) получал раствор голотурина путем непосредственного суспендирования 20 г кювьеровых желез в 50 мл морской воды. При этом железы почти полностью растворялись. Часть полученного раствора подвергалась стерилизации путем автоклавирования. Было установлено, что водная вытяжка из голотурии Actinopyga agassizi, приготовленная в указанном соотношении из кювьеровых желез (20:50), даже при разведении 1:100 000 в течение 23 мин вызывает гибель Cyprinodon baconi Breder. Подкожное введение 0,05 мл полученного раствора голотурина мышам с инокулированной саркомой-180 вызывало во всех случаях четкий регресс опухоли, ее некроз и рассасывание. В дальнейшем, изучая состав водной вытяжки из кювьеровых желез Actinopyga agassizi, исследователи пришли к заключению, что голотурии содержит не менее шести гликозидов стероидной природы, дающих при кислотном гидролизе моносахариды — глюкозу, ксилозу, 3-о-метилглюкозу, хиновозу, серную кислоту и смесь аглю- конов, весьма близких друг к другу по структуре (Chanley et al. 1966).
ПОЛУЧЕНИЕ ГОЛОТУРИНА. В литературе описано несколько способов получения голотурина из морских огурцов. Так, для извлечения голотурина из Holothuria vagabunda разрезанные на части стенки морского огурца кипятят в течение 15 мин. Затем отфильтровывают нерастворившуюся массу. Полученный таким образом темный раствор выпаривают до образования вязкой клейкой жижи, в которую добавляют этанол до содержания 60—70%. Раствор фильтруют, обрабатывают этанолом, доводя его концентрацию в объеме до 94%, и осаждают голотурии в виде белого кристаллического порошка. Выпавший сапонин растворяют в горячем 94%-ном этаноле и кристаллизуют при охлаждении. Операцию перекристаллизации голотурина повторяют несколько раз, добиваясь образования бесцветного осадка сапонина в виде иглоподобных кристаллов. При этом выход чистого голотурина достигает 0,06% от веса свеже- выловленного морского огурца. По другому способу (Chanley et al., 1959) для получения голотурина используют воздушносухие кювьеровы железы Actinopyga agassizi. Железы предварительно в течение нескольких часов обезвоживают кипящим бензолом, который затем отфильтровывают вместе с экстрагированными липидами. Оставшуюся массу кювьеровых органов экстрагируют горячей дистиллированной водой, затем водный раствор смешивают с равным объемом 95%-ного этанола, оставляя смесь отстаиваться в течение 2 дней при комнатной температуре. После освобождения от выпавшего осадка профильтрованный раствор нагревают до кипения и к нему добавляют насыщенный раствор холестерина в горячем 95%-ном этаноле. Смесь помещают в паровую баню на 90 мин при постоянном перемешивании. Затем ее оставляют в течение ночи при комнатной температуре и выпавший комплекс сапонин-холестерина отфуговывают. Далее полученный аддукт промывают для удаления оставшегося непрореагировавшего холестерина водно- этанольной смесью и эфиром и растворяют в пиридине при 45°С, оставляя раствор на несколько часов при комнатной температуре. Затем пиридиновый раствор вливают в этиловый эфир (используют 5-кратный объем последнего), смесь сапонинов отфуговывают и промывают эфиром. Для окончательной очистки используют перекристаллизацию из метанола. При этом способе выход голотурина достигает 49% от веса сухих кювьеровых желез. По более простому способу (Chanley et al., 1966) для получения голотурина применяют высушенные и измельченные в тонкий порошок кювьеровы железы, которые последовательно обезвоживаются и обезжириваются бензолом и растворяются в безводном пиридине при легком нагревании. После отстаивания в течение ночи при комнатной температуре пиридиновый раствор центрифугируется и обрабатывается дважды реактивом Skelly В. Выпавший в осадок голотурии промывается или используется для химического анализа.
СОСТАВ И СВОЙСТВА ГОЛОТУРИНА. Голотурии является смесью весьма близких по структуре гликозидов, из которых большая часть, подобно растительным сапонинам и дигнтони- ну, легко образует комплекс с холестерином. Эту фракцию называют голотурином А и на нее приходится свыше 60% общего содержания гликозидов в голотурине (Chanley et al., 1959). Гликозиды голотурина А состоят из стероидного генина и линейной цепочки четырех моносахаридов, присоединенных по стероидному гидроксилу в третьем положении, и остатка серной кислоты, эфирно связаной с аглюконом. Не образующая комплекс с холестерином гликозидная фракция голотурина была названа голотурином В (Bi). Эту фракцию получили из кювь- еровых органов Actinopyga agassizi после обработки водного извлечения насыщенным раствором холестерина и удаления выпавшего в осадок голотурина А. Из Holothuria vagabunda был выделен также голотурии Вг, отличающийся наличием в углеводной части молекулы только двух (из четырех) моносахаридов— ксилозы и хиновозы (Matsuno, Yamanouchi, 1961). Весьма близкая к голотурину Вг гликозидная фракция, названная голотурином Вз, была изолирована из голотурий Actinopyga lubrica и Holothuria vagabunda. Эта гликозидная фракция легко растворяется в 50%-ном этаноле и в воде, насыщенной н-бута- нолом, но не растворяется в дистиллированной воде, метаноле, этаноле и имеет углеводную часть, аналогичную моносахаридным остаткам голотурина Вг (Yasumoto et al., 1967). Все гли- козидные фракции голотурина являются сернокислыми эфирами (серная кислота присутствует в виде натриевой соли). Элементарный анализ позволяет заключить о следующих эмпирических формулах голотурина: CssHggC^gSNa (голоту
рии A), C4iH650i30S03Na-2H20 (голотурии Вг) и C45IbsOgoSNa (голотурии В3) (Matsuno, Yamanouchi, 1961; Yasumoto et al., 1967). Структурная близость гликозидов, выделенных из различных морских огурцов и морских звезд, весьма значительна. Они различаются чаще лишь моносахаридными остатками углеводной цепи при С3 стероидного скелета. Это позволяет их объединить в одну группу стероидных сапонинов, часто обладающих и общими биологическими эффектами. Структурные характеристики сапонинов, выделенных из изученных видов двух классов иглокожих — морских звезд и огурцов, иллюстративно показывающие близость БАВ этой группы друг к другу, представлены в табл. 33.
Исследование генинов, полученных в процессе гидролиза голотурина А в среде хлористоводородной кислоты, показывает,
КОМПОНЕНТЫ САПОНИНОВ ГОЛОТУРИИ И МОРСКИХ ЗВЕЗД (ПО FRIESS ЕТ AL., 1968) В МОДИФИКАЦИИ
что они имеют весьма 'близкое строение. Используя хроматографические методы, удалось выделить в чистом виде два голоту- риногенина и определить их основные показатели. Один из го- лотуриногенинов оказался 22, 25-оксидоголотуриногенином, другой его 17-дезоксианалогом; они содержались в количестве 20 и 10/о соответственно в смеси аглюконов. Рациональное название 22,25-оксидоголотуриногенина производят исходя из его установленной структуры, это —Зр, 17а, 20?-три-гидрокси- 5а-ланоста-7:8,9:11-диен- 18-карбокси-лактон (18—gt;-20) (Chan- ley et al., 1966). Название других сапогенинов выводят исходя из фактической структуры, принимая генины за производные или 22,25-оксидоголотуриногенина или его 17-дезоксианалога. 22, 25-оксидоголотуриногенин характеризуется следующими показателями: tnn. 315—316°С, [а]^5— 21,2°, эмпирическая формула С30Н44О5. Легко образующиеся соли 22,25-оксидоголоту- риногенина плавятся при температуре 289—290°С (моноацетат), 170—171°С (моно-п-толуенсульфонат) и 30РС (моно-3,5-динитробензоат), Эмпирическая формула 17-дезокси-22, 25-оксидо- голотуриногенина С30Н44О5, tnjI. 286°С, [a]f — 9,3°, tnjI: моно- ацетата 282 283 С. Однако получающиеся в процессе кислотного гидролиза голотуриногенины 22, 25-оксидоголотуриногенин и его 17-дезоксипроизводное отличаются структурно от генинов, образующихся в мягких условиях и представляющих собой неизмененные нативные компоненты природного голотурина. С целью получения немодифицированных агликонов голотури-
на А его гидролиз ведут в среде .безводного метанола, содержащего хлористоводородную кислоту (к 4,24 мл концентрированной хлористоводородной кислоты добавляют метанол до объема 250 мл). Голотурии А суспендируют в подкисленном метаноле, нагревают смесь до 50°С и при постоянном помешивании, проводят процесс в течение 76 ч. В результате мягкого гидролиза получают генуинные агликоны голотурина А: 12р-метокси-7,8- дигидро-22,25-оксидоголотуриногенин и его 17-дезоксианалог; 12р-метокси-7,8-дигидро-24, 25-дегидроголотуриногенин; 12$, 25-диметокси-7,8-дигидроголотуриногенин и 12[}-метс си-22-аце- токси-7,8-дигидроголотуриногенин (Chanley, Rossi, 1969).
Учитывая структурную близость стероидных сапонинов различных голотуринов, большое значение в процессе идентификации и анализа приобретает исследование моносахаридного состава. Получение моносахаридов можно вести в среде 3 н. НС1. При 100°С в течение 3,5 ч гидролиз заканчивается полностью. Агликоны выпадают в осадок, а в надосадочной части остаются водорастворимые сахара. Генины можно извлечь с помощью хлороформа или удалить путем центрифугирования. Присутствие ионов SOf+доказывается реакцией с солями бария. При аналитическом определении моносахаридов в освобожденную от аглюконов и сульфатов надосадочную жидкость добавляют свежеприготовленный карбонат серебра .(при тщательном перемешивании) до образования нейтральной реакции. Выпавший в осадок хлорид серебра удаляют фильтрованием. Фильтрат подвергают хроматографической очистке и или тотчас же анализируют, или раствор сахаров выпаривают досуха в щадящих условиях (лиофилизация) и хранят в таком виде под вакуумом в присутствии P2Q5. При использовании хроматографии на бумаге в системе вода—фенол (1:9) ив системе н-бутанол этанол-вода (5:1:4) получают 4 (в первом случае) и 3 (во втором случае) пятна, величины Rf которых в случае голотурина А совпадают с Rf стандартных образцов З-о-метил-Д-глюко- зы, Д-хиновозы, Д-ксилозы и Д-глюкозы. Их Rf ь системе вода фенол равны соответственно 0,37; 0,45; 0,59; 0,71 и в системе бутанол—этанол—вода — 0,25; 0,35; 0,46. В дальнейшем можно осуществить разделение моносахаридов с помощью хроматографических методов (колоночная или тонкослойная хроматография) и идентифицировать индивидуальные сахара, например по температурам плавления и величине угла вращения. Так, температуры плавления равны соответственно для З-о-метилглюко- зы, Д-глюкозы, ксилозы, глюкометилозы (хиновозы) 161 168°С; 147°С; 148—15ГС; 146°С. В необходимых случаях достаточно убедительным для доказательства наличия сапо: 'енинов голотурина может быть и предварительный фракционный анализ полученной в результате кислотного гидролиза смеси аглюконов. Фракционирование смеси генинов ведут, используя перекристаллизацию генинов из ряда органических растворителей
(ацетонов, эфира и других). Обычно получают 4 фракции с t„ 256—260°С (фракция А), 235—240°С (фракция В), 195,—220°С (фракция С). Четвертая фракция (F) представляет собой маслянистую жидкость (Nigrelli et al., 1955). Из цветных реакций на голотуриногенины наиболее характерной считается образование коричневого окрашивания от добавления к их растворам тетранитрометана.
Голотурии прекрасно растворяется в воде с образованием сильнопенящихся растворов, особенно при значительном разбавлении. Он не растворяется в ацетоне, эфире, хлороформе, этаноле. Не летуч. Легко выдерживает стерилизацию кипячением и автоклавированием. При смешении растворов голотури- на с раствором Люголя последний обесцвечивается. (При добавлении раствора голотурина к раствору метиленового синего окраска последнего раствора не меняется.)
Голотурии А для многих организмов является сильным ядом. Особой чувствительностью к голотурину обладают морские организмы, в частности рыбы, для которых смертельным является содержание 10 мкг/мл суспензии жювьеровых органов (Nigrelli et al., 1955). Токсическое действие голотурина доказано для самых различных видов рыб, обитающих в Тихом и Атлантическом океанах, а также в Средиземном море. В опыте установлено ингибирующее действие голотурина на развитие и рост простейших организмов, моллюсков, червей (Nigrelli, Jakowska, 1960) (табл. 34).
Гибель мышей наступает при внутривенном введении 5— 15 мг1кг голотурина и при интраперитонеальном — 10 мг/кг (Sullivan et al., 1955; Friess et al., 1960). Голотурии обладает также нейротропным, миотропным и гемолитическим эффектами (Friess et al., 1960; Nigrelli, Jakowska, 1960), а также повышает активность фагоцитов теплокровных животных.
Тем не менее наиболее ценным биологическим свойством голотурина является его способность ингибировать рост неко-
Таблица 34
ДЕЙСТВИЕ ГОЛОТУРИНА НА НЕКОТОРЫЕ НЕМОРСКИЕ ОРГАНИЗМЫ (ПО NIGRELLI, JAKOWSKA, 1960)
торых злокачественных новообразований. Цитостатический эффект голотурина впервые был установлен на мышах с имплантированной саркомой-180 (Nigrelli, 1952). В этом случае инъекции суспензии кювьеровых желез, предпринятые через три дня после инокуляции опухоли, вызывали уже на шестой день после трансплантации новообразования распад и значительное уменьшение размеров новообразования. В опытах in vitro с культурой клеток мышиной саркомы-180 было показано, что задержка роста опухолевой культуры голотурином зависит от концентрации последнего в среде (Nigrelli, Zahl, 1952). При использовании суспезии клеток саркомы-180, приготовленной из вытяжек имплантированной животным опухоли 7-дневного развития, содержащей 10 млн клеток в 1 мл, ингибирующее действие голотурина определенно увеличивалось с повышением его ¦введения в среду с 1 миг до 1 мг. После тщательного перемешивания смеси культуры клеток с различными количествами голотурина в течение часа во вращающемся аппарате при температуре 34°'С мышам вводили подкожно по 2-10е опухолевых клеток. Спустя 7 дней развившиеся опухоли иссекали, исследовали и взвешивали. Результаты опыта указывают на то, что предварительная обработка культуры клеток саркомы-180 голотурином значительно угнетает их способность к росту.
В другом эксперименте (Sullivan et al., 1955) было показано, что предварительная обработка культуры опухолевых клеток (асцитная опухоль Кребс-2) 0,1 мг голотурина предотвращает в 100% случаев развитие новообразования после инокуляции 2 • 106 опухолевых клеток. Животные жили и развивались нормально в течение 60 дней наблюдения, имели нормальное потомство, которое, однако, характеризовалось меньшей по сравнению с нормой резистентностью к неопластической инвазии. Контрольные животные, получавшие то же количество клеток опухолевой культуры асцитного новообразования Кребс-2, погибли в среднем через 12,5 дня. В другой части этого опыта на лабораторных животных были получены убедительные данные, подтверждающие прежние сообщения о подавлении роста новообразований голотурином и о зависимости ингибирующего рост опухоли действия голотурина от величины дозы. Мышам- самкам инокулировали стандартные количества высоковирулентной культуры клеток асцитной опухоли Кребс-2 (1—44-106) и через день после трансплантации новообразования начинали инъецировать стерильный раствор голотурина в количествах 0,01, 0,05 и 0,1 мг на инъекцию для соответствующей серии опытных животных. Как у контрольной группы, так и у группы мышей, получавших голотурии в количестве 0,01 мг на инъекцию, ежедневно отмечался бурный рост и развитие новообразований. Животные быстро увеличивались в весе (за счет асцита) и погибали все в течение 7—19 дней. У животных, получавших внутрибрюшинно 0,05 мг голотурина, отмечалась тенденция к
ВЛИЯНИЕ ГОЛОТУРИНА НА МЫШЕЙ С ТРАНСПЛАНТИРОВАННОЙ АСЦИТНОЙ ОПУХОЛЬЮ КРЕБС-2 (ПО SULLIVAN, LADUE, NIGRFLLI, 1955)
замедлению увеличения веса и увелечению продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой мышей с инокули- рованной культурой опухолевых клеток, не получавших голотурии. Отчетливая задержка роста опухоли, замедление в увеличении веса и увеличение продолжительности жизни животных отмечались в эксперименте только после применения более высоких доз голотурина — 0,1 мг на инъекцию. В этом случае после 7—10 инъекций раствора голотурина средняя продолжительность жизни животных увеличилась до 34,6 дня (контроль^— 13,7 дня) и средний вес животных составил 20,6 г (контроль — 30,2 г). Четверо животных из группы 24 мышей, получавших по 0,1 мг голотурина в течение 20 дней (10 инъекций), жили 6 мес.
С целью выяснения значения специфичности химической структуры гликозидов голотурина для ингибирующего действия на рост асцитной опухоли Кребс-2 была выполнена большая экспериментальная работа (табл. 35). Мышам линии JCR ино- кулировали по 2-406 клеток асцитной опухоли и начинали производить инъекции 0,1 мг голотурина, контрольным животным с привитой опухолью вводили адекватно препараты стероидной структуры —- сапонины, гликозиды, включая строфантин, диги- талин, дигитонин и т. д.— всего 50 наименований. На десятый день средний вес группы животных, получавших голотурии, составил 23,5 г, а средний вес животных контрольных групп — 32 г. Средняя продолжительность жизни животных в контрольных группах составила 11,9 дня, животных, получавших голотурии — 25,4 дня; 11 мышей, леченные голотурином, жили более 15 мес каждая (Sullivan, Nigrelli., 1956).
Экспериментально была показана также ингибирующая ак-
тивность голотурина из Actinopyga agassizi в отношении адено- карциноматоза мышей (Leither et al., 1962) и эпидермальной карциномы человека в культуре (Nigrelli et al., 1967).
Nigrelli (1960) при попытке фракционирования голотурина А с целью получения более чистых, свободных от примесей образцов, которые бы обладали одновременно и меньшей токсичностью, получил препарат—фракцию стероидных сапонинов, характеризующуюся весьма низкой токсичностью (в 10 раз меньшей, чем голотурии А) и совершенно лишенную цитостати- ческой активности. Следует, однако, отметить при этом, что в процессе очистки голотурина могут иметь место различные нарушения молекулярного состава препарата, включающие возможное отщепление эфирносвязанных серной кислоты или сахаров. Для проявления биологической активности, как известно, необходимо обычно полное сохранение структуры соединения. Так, например, стероидный гликозид голотоксин, выделенный из морского огурца Stichopus japonicus, по аналитической характеристике весьма близок к голотурину, отличаясь от последнего отсутствием остатка серной кислоты. Голотоксин — сильное противогрибковое средство, а голотурии — явный цитостатик (Shimada, 1969). Среди обследованных весьма немногочисленных в процентном отношении видов иглокожих наиболее распространенными биологически активными веществами являются голотурии и голотуриноподобные вещества (Nigrelli et al., 1967). Лишь незначительно отличаясь друг от друга в структурном отношении, в большинстве случаев эти БАВ, выделенные ив многих видов морских огурцов и морских звезд, характеризуются столь же близким спектром биологической активности — цитостатическим, нейротропным, миотропным действием. При определении ингибирующего рост новообразований действия БАВ, выделенных из различных видов Echinodermata, это удается подтвердить.
Сапонины морских звезд — астеросапонины — имеют очень близкую к голотурину стероидную природу и наряду с ним характеризуются эквивалентными биологическими эффектами. Астеросапонины, как и голотурии, образуют при гидролизе стероидные генины, серную кислоту и различные моносахариды. Как правило, именно индивидуальные различия физико-химических характеристик и биологического действия отдельных сапонинов, выделенных из морских звезд и голотурий, основываются на различном качественном и количественном содержании остатков молекул. Так, астеросапонин А, выделенный из Aste- rias amurensis, Astropecten scoparius, Asterina pectinifera, Cos- cinasterial acutispina, образует при кислотном гидролизе стероидный гении, серную кислоту и по моносахариду — d-хиновозу и d-фукозу, а астеросапонин В — помимо указанных моноз еще -ксилозу и d-галактозу. Астеросапонины А, изолированные из хоокеанской морской звезды Pycnopodia helianthoides, харак
теризуются наличием уже других сахаров, в частности рамнозы. Сходная каотинз обнаружена при установлении структуры астеросапонинов Acterias forbesi, Patiria minata, Pisaster ochra- ceous и Pisaster brevispinus. При наличии общего стероидного генина, этерифицированного серной кислотой, они различаются моносахаридным составом углеводного компонента (Rio et al.,
Значительный ассортимент стероидных сапонинов с очевидным ингибирующим действием на рост и развитие некоторых видов злокачественных новообразований в вытяжках из морских звезд и голотурий привлекли внимание исследователей к этим группам гидробионтов. В процессе десятилетних экспериментально-поисковых работ исследователям Аризонского университета удалось обнаружить несколько видов морских огурцов, продуцирующих БАВ, характеризующихся высокой цитостати- ческой, антинеопластической активностью (Pettit et al., 1976). В частности, подобные БАВ, представляющие собой комплекс стероидных сапонинов ланостанового ряда, были выделены из голотурий Stichopus chloronotus Brandt (прибрежные зоны Австралии), Thelenota ananas jalger (район Тайваня и Маршальских островов) и Actinopyga mauritiana (побережье Гавайских островов). Выделенные из кювьеровых желез БАВ были названы соответственно стихостатином-1, теленостатином-1, ак- тиностатином-1. Стихостатин-1 получали из Stichopus chloronotus путем экстракции измельченных кювьеровых желез пропанолом и последующего противоточного распределения между бензолом и водой. Водная фаза экстрагируется 1-бутанолом, бутанольная фракция подвергается противоточному распределению (эфир—вода). После вымораживания водной фазы получают смесь стероидных сапонинов, очистка которых осуществляется на колонке с кремниевой кислотой (элюэнт—хлороформ—метанол,—вода; 20:5:0,5) с последующей перекристаллизацией из хлороформ—метанола. Стихостатин-1 образует из данной смеси игольчатые кристаллы с tnjI. 279—280°С. Молекулярный вес стихостатина-1, определенный осмометрически, равен 1200, эмпирическая формула €54-5бН93-98 0 27-28- Аналогичным образом получают ланостаниды: теленостатин-1 и актино- статин-1 из Thelenota ananas и Actinopyga mauritiana, образующих также игольчатой формы кристаллы с tra. 213—217°С и 218—220°С соответственно.
Изучение структуры выделенных из тихоокеанских голотурий сапонинов показало, что все они являются стероидами,
близкими по строению ранее описанным БАВ—голотоксину А, изолированному из морского огурца Stichopus japonicus Selenka, обладающего сильным противогрибковым действием, и голоту- рину А — из Actinopyga agassizi, обладающего цитостатическим действием. Подобно голотоксину стихостатин-1 не образует при гидролизе сульфат-ион, в то время как теленостатин-1 и акти- ностатин-1, как и голотурии А, содержат эфирносвязанную серную кислоту. Биологические испытания показали, что новым сапонинам, выделенным из трех тихоокеанских видов морских огурцов, свойственна сильная антинеопластическая активность за счет ингибирования внутриклеточного синтеза белка и рибонуклеиновой кислоты.
Лишь крайне незначительная часть иглокожих исследована на наличие БАВ и совсем ничтожная часть их — на наличие БАВ цитостатического действия. Поэтому можно ожидать открытия новых БАВ.— ингибиторов роста различных новообразований. В подтверждение приведенного соображения можно указать на факт обнаружения БАВ, обладающих выраженной антинеопластической активностью в экстрактах, полученных из большой группы ранее не обследованных на наличие БАВ видов иглокожих (Luidia clatrata, Astropecten, Scoparius, Pisaster ochraceous, Lytechinus variegalus). Их экстракты ингибируют развитие карциномы Уокера-256 и лейкемии L-1210 и RS (Pettit, Day, 1970).
Таким образом, целенаправленный поиск БАВ цитостатического действия среди продуктов метаболизма морских организмов имеет совсем еще краткую историю. Фактически начало первому научно обоснованному поиску «цитостатиков моря» было положено только в 1966 г. в связи с утверждением National Sea Grant Programm. С этого времени и ведет свое начало планомерное изучение гидробионтов на наличие БАВ, в том числе и цитостатического действия. Открытию новых БАВ, обладающих ингибирующих действием на рост быстро пролиферирующих тканей, в значительной степени способствовала разработка новых методов фармакологического скрининга цитостатиков и новых тест-культур и методов. Используя новые технологические приемы получения нативных вытяжек из тканей гидробионтов и новые объекты исследования, ученым удалось расширить ассортимент изучаемых объектов. Среди наиболее перспективных продуцентов БАВ цитостатического действия были открыты различные виды рыб, моллюсков, губок и особенно кишечнополостных. Подлинной удачей следует считать открытие цитостатического действия палитоксина — вещества, в ничтожных дозах (5 нг/кг) тормозящего рост малигнизированных клеток. Интенсивное изучение 'биологии размножения, дифференциации пола у кишечнополостных и роста в последние годы позволило выяснить физиологические механизмы действия палитоксина — сильнейшего регулятора половой функции
самых низших животных организмов моря, а вместе с тем указало на один из наиболее плодотворных путей поиска новых БАБ, способных регулировать клеточное деление и дифференциацию, что привело к открытию новых видов полипов—продуцентов палитоксиноподобных веществ, способных воздействовать на более широкий спектр злокачественных новообразований. Наряду с палитоксином другие виды коралловых полипов, очевидно, используют аналогичный механизм контроля половой активности и клеточной дифференциации, вырабатывая, что нельзя исключить, иной природы химические соединения. Наличие палитоксина установлено всего у нескольких видов коралловых полипов, однако даже и среди этих продуцентов БАБ, ответственные за рост и развитие организмов, в значительной мере различаются спектром цитостатического действия и токсичности. Что же можно сказать о биопродукции остальных почти 6000 видов коралловых полипов, исследование которых на наличие БАБ цитостатического действия в абсолютном большинстве случаев еще не начато?
Это в полной мере относится и к другим таксономическим единицам — морским звездам, морским огурцам, рыбам, из тканей которых выделены потенциально интересные БАБ, и, конечно же, к моллюскам, насчитывающим свыше 100 000 различных видов. Изучение всех групп морских организмов на наличие БАБ вообще, в том числе и цитостатического действия, только-только началось. И можно с уверенностью ожидать, что в процессе исследования будут открыты совершенно новые соединения, а вместе с ними и новые методы воздействия на рост быстропролиферирующих тканей (И. С. Ажгихин с соавт., 1977).
Большой интерес представляет изучение химической структуры БАБ морских организмов, анализ которой позволяет в ряде случаев синтезировать аналоги природных и синтетических цнтостатиков. Так было в случае с нуклеозидами карибской губки Cryptotethya crypta: созданные на их основе цитидин- арабинозиды прочно вошли в арсенал наиболее эффективных современных средств химиотерапии лейкозов. Во многих случаях БАБ гидробионтов характеризуются наличием оригинального химического строения и обладают нередко необычайно выраженным физиологическим действием. Можно предположить, что после выяснения структуры соединений типа палитоксина следует ожидать синтеза его аналогов, лишенных побочных, нежелательных действий. Во всех случаях , когда БАБ гидробионтов вообще может представить практический интерес, его модификация и дальнейшая судьба будут тесно связаны с синтетической химией (И. С. Ажгихин с соавт., 1977).
Морские организмы представляют большой интерес не только как источники специфических БАБ цитостатического действия, но и как колоссальный источник для получения основно
го компонента универсального механизма контроля клеточного деления — келонов. Будучи тканеспецифическими, эти белковые субстанции не обладают видовой с
13 Зак. 889
лее перспективным представляется класс морских огурцов — Holothuroidea — четвертый класс иглокожих. Вообще иглокожие, являющиеся весьма своеобразной группой морских животных, подразделяются на 5 больших классов: морские звезды — Asteroidea (I). змеехвостки —Ophiureidea (II), морские ежи — Echinoidea (III), морские огурцы (голотурии) — Holothuroidea (IV), морские лилии — Crinoidea (V).
Иглокожие водятся исключительно в морях, причем обитают на любой доступной глубине. Они ведут придонный образ жизни, передвигаются по грунту. Их основная пища — животные организмы, в том числе рыбы. Сами иглокожие поедаются различными морскими организмами, например треской. В пределах территориальных вод Советского Союза наибольшие скопления иглокожих отмечаются в морях Тихого и Северного Ледовитого океанов, меньше — в Черном и Балтийском морях и совсем их нет в Каспийском море. Из перечисленных классов иглокожих наиболее обследованными являются морские звезды и особенно голотурии. Голотурии, напоминающие при сокращении своего мешковидного тела свежие огурцы, достигают больших размеров—до 2 метров и более, хотя большинство видов, а их насчитывается около 900, характеризуется более скормными размерами— 10—40 см. Это малоподвижные животные, еле передвигающиеся обычно по дну в поисках животной пищи. Отдельные виды голотурий обладают оригинальным приспособлением, очевидно, имеющим защитное назначение: специальным железистым аппаратом — кювьеровыми органами. При опасности голотурии выбрасывают кювьеровы органы, содержащие клейкую, густоватую, высоко токсичную жидкость, через иголку наружу, прямо на видимого противника. Многие виды морских огурцов (около 40) употребляются человеком в пищу под названием трепангов.
Наиболее известными голотуриями, встречающимися в территориальных водах нашей страны, являются японский промысловый морской огурец Cucumaria japonica и промысловая голотурия (дальневосточный трепанг) Stichopus japonicus. Первый вид — Cucumaria japonica —- в огромном количестве встречается в Японском, Охотском и Беринговом морях и'вылавливается донными тралами (до 12—15 ц за одно траление). Stichopus japonicus имеет промысловое значение и подвергается отлову и заготовке. Многие из изученных видов морских звезд и голотурий продуцируют высокотоксичные соединения, экологическое значение которых обычно связывают с процессом борьбы за существование. О наличии ядовитых веществ в организме морских звезд и голотурий сообщалось еще в 1886 г. (Halstead, 1965). Однако серьезное внимание БАВ этих классов привлекли к себе после работ Nigrelli, открывшего среди них стероидные сапонины с выраженным цитостатическим эффектом. По существу, описанный в начале 50-х годов нашего
столетия стероидный сапонин голотурии, выделенный Nigrelli из багамской голотурии Actinopyga agassizi, явился первым сапонином животного происхождения. В последующие годы БАБ гликозидной природы были извлечены из нескольких десятков видов морских огурцов и звезд. В большинстве своем выделенные БАБ имели в основном стероидный углеродный скелет с различными боковыми цепями. Наибольший интерес исследователей привлекли к себе описанные многими авторами стероидные сапонины, объединенные общим термином —голотурии.
Под названием «голотурии» были изолированы БАВ из Но- lothuria vagabunda еще в начале 40-х годов. Тем не менее интенсивное изучение токсинов морских огурцов началось только после опубликования результатов экспериментов Nigrelli (1952) об ингибирующем действии БАВ, полученного им из экстрактов тканей Actinopyga agassizi в отношении роста саркомы-180 у мышей. Следует отметить, что несколько ранее появились сообщения о выраженном угнетении клеточного деления вытяжек из различных тканей морских организмов, в частности из моллюсков и морских звезд (Heilbrunn et al., 1951). Авторы указывали, что как водные, так и водно-спиртовые вытяжки из гидробионтов и особенно морских звезд обладают сильным антимитозным действием за счет влияния на синтез белковых макромолекул и коллоидную структуру протоплазмы клеток, и высказали предположение о несомненной перспективности поиска цитостатических и антимитозных веществ среди БАВ гидробионтов. В этих условиях появление краткого, всего на одну страницу, сообщения вызвало особенный интерес к БАВ, продуцируемых голотуриями. В своих опытах Nigrelli использовал водный раствор комплекса БАВ, содержащихся в кювьеровых органах. Это был очень простой галеновый препарат БАВ голотурии. Однако опыты в связи с определением биологической активности этого галенового препарата вызвали большой резонанс и имели далеко идущие последствия для перспективного поиска новых цитостатиков среди БАВ морских организмов. В своем первом эксперименте Nigrelli (1952) получал раствор голотурина путем непосредственного суспендирования 20 г кювьеровых желез в 50 мл морской воды. При этом железы почти полностью растворялись. Часть полученного раствора подвергалась стерилизации путем автоклавирования. Было установлено, что водная вытяжка из голотурии Actinopyga agassizi, приготовленная в указанном соотношении из кювьеровых желез (20:50), даже при разведении 1:100 000 в течение 23 мин вызывает гибель Cyprinodon baconi Breder. Подкожное введение 0,05 мл полученного раствора голотурина мышам с инокулированной саркомой-180 вызывало во всех случаях четкий регресс опухоли, ее некроз и рассасывание. В дальнейшем, изучая состав водной вытяжки из кювьеровых желез Actinopyga agassizi, исследователи пришли к заключению, что голотурии содержит не менее шести гликозидов стероидной природы, дающих при кислотном гидролизе моносахариды — глюкозу, ксилозу, 3-о-метилглюкозу, хиновозу, серную кислоту и смесь аглю- конов, весьма близких друг к другу по структуре (Chanley et al. 1966).
ПОЛУЧЕНИЕ ГОЛОТУРИНА. В литературе описано несколько способов получения голотурина из морских огурцов. Так, для извлечения голотурина из Holothuria vagabunda разрезанные на части стенки морского огурца кипятят в течение 15 мин. Затем отфильтровывают нерастворившуюся массу. Полученный таким образом темный раствор выпаривают до образования вязкой клейкой жижи, в которую добавляют этанол до содержания 60—70%. Раствор фильтруют, обрабатывают этанолом, доводя его концентрацию в объеме до 94%, и осаждают голотурии в виде белого кристаллического порошка. Выпавший сапонин растворяют в горячем 94%-ном этаноле и кристаллизуют при охлаждении. Операцию перекристаллизации голотурина повторяют несколько раз, добиваясь образования бесцветного осадка сапонина в виде иглоподобных кристаллов. При этом выход чистого голотурина достигает 0,06% от веса свеже- выловленного морского огурца. По другому способу (Chanley et al., 1959) для получения голотурина используют воздушносухие кювьеровы железы Actinopyga agassizi. Железы предварительно в течение нескольких часов обезвоживают кипящим бензолом, который затем отфильтровывают вместе с экстрагированными липидами. Оставшуюся массу кювьеровых органов экстрагируют горячей дистиллированной водой, затем водный раствор смешивают с равным объемом 95%-ного этанола, оставляя смесь отстаиваться в течение 2 дней при комнатной температуре. После освобождения от выпавшего осадка профильтрованный раствор нагревают до кипения и к нему добавляют насыщенный раствор холестерина в горячем 95%-ном этаноле. Смесь помещают в паровую баню на 90 мин при постоянном перемешивании. Затем ее оставляют в течение ночи при комнатной температуре и выпавший комплекс сапонин-холестерина отфуговывают. Далее полученный аддукт промывают для удаления оставшегося непрореагировавшего холестерина водно- этанольной смесью и эфиром и растворяют в пиридине при 45°С, оставляя раствор на несколько часов при комнатной температуре. Затем пиридиновый раствор вливают в этиловый эфир (используют 5-кратный объем последнего), смесь сапонинов отфуговывают и промывают эфиром. Для окончательной очистки используют перекристаллизацию из метанола. При этом способе выход голотурина достигает 49% от веса сухих кювьеровых желез. По более простому способу (Chanley et al., 1966) для получения голотурина применяют высушенные и измельченные в тонкий порошок кювьеровы железы, которые последовательно обезвоживаются и обезжириваются бензолом и растворяются в безводном пиридине при легком нагревании. После отстаивания в течение ночи при комнатной температуре пиридиновый раствор центрифугируется и обрабатывается дважды реактивом Skelly В. Выпавший в осадок голотурии промывается или используется для химического анализа.
СОСТАВ И СВОЙСТВА ГОЛОТУРИНА. Голотурии является смесью весьма близких по структуре гликозидов, из которых большая часть, подобно растительным сапонинам и дигнтони- ну, легко образует комплекс с холестерином. Эту фракцию называют голотурином А и на нее приходится свыше 60% общего содержания гликозидов в голотурине (Chanley et al., 1959). Гликозиды голотурина А состоят из стероидного генина и линейной цепочки четырех моносахаридов, присоединенных по стероидному гидроксилу в третьем положении, и остатка серной кислоты, эфирно связаной с аглюконом. Не образующая комплекс с холестерином гликозидная фракция голотурина была названа голотурином В (Bi). Эту фракцию получили из кювь- еровых органов Actinopyga agassizi после обработки водного извлечения насыщенным раствором холестерина и удаления выпавшего в осадок голотурина А. Из Holothuria vagabunda был выделен также голотурии Вг, отличающийся наличием в углеводной части молекулы только двух (из четырех) моносахаридов— ксилозы и хиновозы (Matsuno, Yamanouchi, 1961). Весьма близкая к голотурину Вг гликозидная фракция, названная голотурином Вз, была изолирована из голотурий Actinopyga lubrica и Holothuria vagabunda. Эта гликозидная фракция легко растворяется в 50%-ном этаноле и в воде, насыщенной н-бута- нолом, но не растворяется в дистиллированной воде, метаноле, этаноле и имеет углеводную часть, аналогичную моносахаридным остаткам голотурина Вг (Yasumoto et al., 1967). Все гли- козидные фракции голотурина являются сернокислыми эфирами (серная кислота присутствует в виде натриевой соли). Элементарный анализ позволяет заключить о следующих эмпирических формулах голотурина: CssHggC^gSNa (голоту
рии A), C4iH650i30S03Na-2H20 (голотурии Вг) и C45IbsOgoSNa (голотурии В3) (Matsuno, Yamanouchi, 1961; Yasumoto et al., 1967). Структурная близость гликозидов, выделенных из различных морских огурцов и морских звезд, весьма значительна. Они различаются чаще лишь моносахаридными остатками углеводной цепи при С3 стероидного скелета. Это позволяет их объединить в одну группу стероидных сапонинов, часто обладающих и общими биологическими эффектами. Структурные характеристики сапонинов, выделенных из изученных видов двух классов иглокожих — морских звезд и огурцов, иллюстративно показывающие близость БАВ этой группы друг к другу, представлены в табл. 33.
Исследование генинов, полученных в процессе гидролиза голотурина А в среде хлористоводородной кислоты, показывает,
КОМПОНЕНТЫ САПОНИНОВ ГОЛОТУРИИ И МОРСКИХ ЗВЕЗД (ПО FRIESS ЕТ AL., 1968) В МОДИФИКАЦИИ
|
Сапонин |
Источник |
Сахар |
Формула |
Молеку лярный вес |
|
ГолотуринА |
Actinopyga agassizi Holothurla vagabunda Holothurla Iubrica |
Д-ксилоза Д-глюкоза З-о-метил- Д-глюкоза Д-хиновоза |
^50—52Н81—85O25—26 SNa ^55^99029 SNa |
1159 1279 |
|
Голотурин В |
Holothuria vagabunda Holothuria Iubrica |
Д-ксилоза Д-хиновоза |
С45Н75О20 SNa |
991 |
|
Астеросапо- нин А |
Asterias amurensis |
Д-хиновоза Д-фукоза |
^50—52^88—90^25--26 SNa |
1141 |
|
Астеросапо- нин В |
Asterias amurensis |
Д-хиновоза Д-фукоза Д-ксилоза Д-галактоза |
Q54H101O32 SNa |
1341 |
что они имеют весьма 'близкое строение. Используя хроматографические методы, удалось выделить в чистом виде два голоту- риногенина и определить их основные показатели. Один из го- лотуриногенинов оказался 22, 25-оксидоголотуриногенином, другой его 17-дезоксианалогом; они содержались в количестве 20 и 10/о соответственно в смеси аглюконов. Рациональное название 22,25-оксидоголотуриногенина производят исходя из его установленной структуры, это —Зр, 17а, 20?-три-гидрокси- 5а-ланоста-7:8,9:11-диен- 18-карбокси-лактон (18—gt;-20) (Chan- ley et al., 1966). Название других сапогенинов выводят исходя из фактической структуры, принимая генины за производные или 22,25-оксидоголотуриногенина или его 17-дезоксианалога. 22, 25-оксидоголотуриногенин характеризуется следующими показателями: tnn. 315—316°С, [а]^5— 21,2°, эмпирическая формула С30Н44О5. Легко образующиеся соли 22,25-оксидоголоту- риногенина плавятся при температуре 289—290°С (моноацетат), 170—171°С (моно-п-толуенсульфонат) и 30РС (моно-3,5-динитробензоат), Эмпирическая формула 17-дезокси-22, 25-оксидо- голотуриногенина С30Н44О5, tnjI. 286°С, [a]f — 9,3°, tnjI: моно- ацетата 282 283 С. Однако получающиеся в процессе кислотного гидролиза голотуриногенины 22, 25-оксидоголотуриногенин и его 17-дезоксипроизводное отличаются структурно от генинов, образующихся в мягких условиях и представляющих собой неизмененные нативные компоненты природного голотурина. С целью получения немодифицированных агликонов голотури-
на А его гидролиз ведут в среде .безводного метанола, содержащего хлористоводородную кислоту (к 4,24 мл концентрированной хлористоводородной кислоты добавляют метанол до объема 250 мл). Голотурии А суспендируют в подкисленном метаноле, нагревают смесь до 50°С и при постоянном помешивании, проводят процесс в течение 76 ч. В результате мягкого гидролиза получают генуинные агликоны голотурина А: 12р-метокси-7,8- дигидро-22,25-оксидоголотуриногенин и его 17-дезоксианалог; 12р-метокси-7,8-дигидро-24, 25-дегидроголотуриногенин; 12$, 25-диметокси-7,8-дигидроголотуриногенин и 12[}-метс си-22-аце- токси-7,8-дигидроголотуриногенин (Chanley, Rossi, 1969).
Учитывая структурную близость стероидных сапонинов различных голотуринов, большое значение в процессе идентификации и анализа приобретает исследование моносахаридного состава. Получение моносахаридов можно вести в среде 3 н. НС1. При 100°С в течение 3,5 ч гидролиз заканчивается полностью. Агликоны выпадают в осадок, а в надосадочной части остаются водорастворимые сахара. Генины можно извлечь с помощью хлороформа или удалить путем центрифугирования. Присутствие ионов SOf+доказывается реакцией с солями бария. При аналитическом определении моносахаридов в освобожденную от аглюконов и сульфатов надосадочную жидкость добавляют свежеприготовленный карбонат серебра .(при тщательном перемешивании) до образования нейтральной реакции. Выпавший в осадок хлорид серебра удаляют фильтрованием. Фильтрат подвергают хроматографической очистке и или тотчас же анализируют, или раствор сахаров выпаривают досуха в щадящих условиях (лиофилизация) и хранят в таком виде под вакуумом в присутствии P2Q5. При использовании хроматографии на бумаге в системе вода—фенол (1:9) ив системе н-бутанол этанол-вода (5:1:4) получают 4 (в первом случае) и 3 (во втором случае) пятна, величины Rf которых в случае голотурина А совпадают с Rf стандартных образцов З-о-метил-Д-глюко- зы, Д-хиновозы, Д-ксилозы и Д-глюкозы. Их Rf ь системе вода фенол равны соответственно 0,37; 0,45; 0,59; 0,71 и в системе бутанол—этанол—вода — 0,25; 0,35; 0,46. В дальнейшем можно осуществить разделение моносахаридов с помощью хроматографических методов (колоночная или тонкослойная хроматография) и идентифицировать индивидуальные сахара, например по температурам плавления и величине угла вращения. Так, температуры плавления равны соответственно для З-о-метилглюко- зы, Д-глюкозы, ксилозы, глюкометилозы (хиновозы) 161 168°С; 147°С; 148—15ГС; 146°С. В необходимых случаях достаточно убедительным для доказательства наличия сапо: 'енинов голотурина может быть и предварительный фракционный анализ полученной в результате кислотного гидролиза смеси аглюконов. Фракционирование смеси генинов ведут, используя перекристаллизацию генинов из ряда органических растворителей
(ацетонов, эфира и других). Обычно получают 4 фракции с t„ 256—260°С (фракция А), 235—240°С (фракция В), 195,—220°С (фракция С). Четвертая фракция (F) представляет собой маслянистую жидкость (Nigrelli et al., 1955). Из цветных реакций на голотуриногенины наиболее характерной считается образование коричневого окрашивания от добавления к их растворам тетранитрометана.
Голотурии прекрасно растворяется в воде с образованием сильнопенящихся растворов, особенно при значительном разбавлении. Он не растворяется в ацетоне, эфире, хлороформе, этаноле. Не летуч. Легко выдерживает стерилизацию кипячением и автоклавированием. При смешении растворов голотури- на с раствором Люголя последний обесцвечивается. (При добавлении раствора голотурина к раствору метиленового синего окраска последнего раствора не меняется.)
Голотурии А для многих организмов является сильным ядом. Особой чувствительностью к голотурину обладают морские организмы, в частности рыбы, для которых смертельным является содержание 10 мкг/мл суспензии жювьеровых органов (Nigrelli et al., 1955). Токсическое действие голотурина доказано для самых различных видов рыб, обитающих в Тихом и Атлантическом океанах, а также в Средиземном море. В опыте установлено ингибирующее действие голотурина на развитие и рост простейших организмов, моллюсков, червей (Nigrelli, Jakowska, 1960) (табл. 34).
Гибель мышей наступает при внутривенном введении 5— 15 мг1кг голотурина и при интраперитонеальном — 10 мг/кг (Sullivan et al., 1955; Friess et al., 1960). Голотурии обладает также нейротропным, миотропным и гемолитическим эффектами (Friess et al., 1960; Nigrelli, Jakowska, 1960), а также повышает активность фагоцитов теплокровных животных.
Тем не менее наиболее ценным биологическим свойством голотурина является его способность ингибировать рост неко-
Таблица 34
ДЕЙСТВИЕ ГОЛОТУРИНА НА НЕКОТОРЫЕ НЕМОРСКИЕ ОРГАНИЗМЫ (ПО NIGRELLI, JAKOWSKA, 1960)
|
Вид организма |
Концентрация голотурина, моль |
Эффект |
|
Ochromonas malhemensis Euglena gracilis Amoeba proteus Tetrahymena pyrilormis Paramecium candatum Hydra (коричневая) Nematodes (свободноживущие) Planorbis sp. Tubifex tubifex |
22 66 100 22 Ю 10 100 1—10 10 |
Задержка роста Гибель Задержка роста Г ибель ¦в»*-» |
торых злокачественных новообразований. Цитостатический эффект голотурина впервые был установлен на мышах с имплантированной саркомой-180 (Nigrelli, 1952). В этом случае инъекции суспензии кювьеровых желез, предпринятые через три дня после инокуляции опухоли, вызывали уже на шестой день после трансплантации новообразования распад и значительное уменьшение размеров новообразования. В опытах in vitro с культурой клеток мышиной саркомы-180 было показано, что задержка роста опухолевой культуры голотурином зависит от концентрации последнего в среде (Nigrelli, Zahl, 1952). При использовании суспезии клеток саркомы-180, приготовленной из вытяжек имплантированной животным опухоли 7-дневного развития, содержащей 10 млн клеток в 1 мл, ингибирующее действие голотурина определенно увеличивалось с повышением его ¦введения в среду с 1 миг до 1 мг. После тщательного перемешивания смеси культуры клеток с различными количествами голотурина в течение часа во вращающемся аппарате при температуре 34°'С мышам вводили подкожно по 2-10е опухолевых клеток. Спустя 7 дней развившиеся опухоли иссекали, исследовали и взвешивали. Результаты опыта указывают на то, что предварительная обработка культуры клеток саркомы-180 голотурином значительно угнетает их способность к росту.
В другом эксперименте (Sullivan et al., 1955) было показано, что предварительная обработка культуры опухолевых клеток (асцитная опухоль Кребс-2) 0,1 мг голотурина предотвращает в 100% случаев развитие новообразования после инокуляции 2 • 106 опухолевых клеток. Животные жили и развивались нормально в течение 60 дней наблюдения, имели нормальное потомство, которое, однако, характеризовалось меньшей по сравнению с нормой резистентностью к неопластической инвазии. Контрольные животные, получавшие то же количество клеток опухолевой культуры асцитного новообразования Кребс-2, погибли в среднем через 12,5 дня. В другой части этого опыта на лабораторных животных были получены убедительные данные, подтверждающие прежние сообщения о подавлении роста новообразований голотурином и о зависимости ингибирующего рост опухоли действия голотурина от величины дозы. Мышам- самкам инокулировали стандартные количества высоковирулентной культуры клеток асцитной опухоли Кребс-2 (1—44-106) и через день после трансплантации новообразования начинали инъецировать стерильный раствор голотурина в количествах 0,01, 0,05 и 0,1 мг на инъекцию для соответствующей серии опытных животных. Как у контрольной группы, так и у группы мышей, получавших голотурии в количестве 0,01 мг на инъекцию, ежедневно отмечался бурный рост и развитие новообразований. Животные быстро увеличивались в весе (за счет асцита) и погибали все в течение 7—19 дней. У животных, получавших внутрибрюшинно 0,05 мг голотурина, отмечалась тенденция к
ВЛИЯНИЕ ГОЛОТУРИНА НА МЫШЕЙ С ТРАНСПЛАНТИРОВАННОЙ АСЦИТНОЙ ОПУХОЛЬЮ КРЕБС-2 (ПО SULLIVAN, LADUE, NIGRFLLI, 1955)
|
Число животных |
Доза голотурина, мг |
Количество инъекций |
Средняя продолжительность жизни, дни |
Средний вес в 1-й день инокуляции опухолевых клеток, г |
Средний вес мышей через 10 дней после инокуляции опухолевых клеток, г |
|
12 |
Контроль |
Контроль 7 инъекций за |
13,7 |
21,7 |
30,2 |
|
6 |
0,01 |
8 дней 7 инъекций за |
8,5 |
21,6 |
— |
|
6 |
0,05 |
8 дней 7 инъекций за |
19,5 |
20,0 |
23,2 |
|
6 |
0,10 |
16 дней 10 инъекций за |
23,5 |
22,7 |
20,6 |
|
6 |
0,10 |
21 день 10 инъекций за |
34,6 |
21,9 |
20,6 |
|
24 |
0,10 |
20 дней |
25,4 |
23,3 |
23,5 |
замедлению увеличения веса и увелечению продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой мышей с инокули- рованной культурой опухолевых клеток, не получавших голотурии. Отчетливая задержка роста опухоли, замедление в увеличении веса и увеличение продолжительности жизни животных отмечались в эксперименте только после применения более высоких доз голотурина — 0,1 мг на инъекцию. В этом случае после 7—10 инъекций раствора голотурина средняя продолжительность жизни животных увеличилась до 34,6 дня (контроль^— 13,7 дня) и средний вес животных составил 20,6 г (контроль — 30,2 г). Четверо животных из группы 24 мышей, получавших по 0,1 мг голотурина в течение 20 дней (10 инъекций), жили 6 мес.
С целью выяснения значения специфичности химической структуры гликозидов голотурина для ингибирующего действия на рост асцитной опухоли Кребс-2 была выполнена большая экспериментальная работа (табл. 35). Мышам линии JCR ино- кулировали по 2-406 клеток асцитной опухоли и начинали производить инъекции 0,1 мг голотурина, контрольным животным с привитой опухолью вводили адекватно препараты стероидной структуры —- сапонины, гликозиды, включая строфантин, диги- талин, дигитонин и т. д.— всего 50 наименований. На десятый день средний вес группы животных, получавших голотурии, составил 23,5 г, а средний вес животных контрольных групп — 32 г. Средняя продолжительность жизни животных в контрольных группах составила 11,9 дня, животных, получавших голотурии — 25,4 дня; 11 мышей, леченные голотурином, жили более 15 мес каждая (Sullivan, Nigrelli., 1956).
Экспериментально была показана также ингибирующая ак-
тивность голотурина из Actinopyga agassizi в отношении адено- карциноматоза мышей (Leither et al., 1962) и эпидермальной карциномы человека в культуре (Nigrelli et al., 1967).
Nigrelli (1960) при попытке фракционирования голотурина А с целью получения более чистых, свободных от примесей образцов, которые бы обладали одновременно и меньшей токсичностью, получил препарат—фракцию стероидных сапонинов, характеризующуюся весьма низкой токсичностью (в 10 раз меньшей, чем голотурии А) и совершенно лишенную цитостати- ческой активности. Следует, однако, отметить при этом, что в процессе очистки голотурина могут иметь место различные нарушения молекулярного состава препарата, включающие возможное отщепление эфирносвязанных серной кислоты или сахаров. Для проявления биологической активности, как известно, необходимо обычно полное сохранение структуры соединения. Так, например, стероидный гликозид голотоксин, выделенный из морского огурца Stichopus japonicus, по аналитической характеристике весьма близок к голотурину, отличаясь от последнего отсутствием остатка серной кислоты. Голотоксин — сильное противогрибковое средство, а голотурии — явный цитостатик (Shimada, 1969). Среди обследованных весьма немногочисленных в процентном отношении видов иглокожих наиболее распространенными биологически активными веществами являются голотурии и голотуриноподобные вещества (Nigrelli et al., 1967). Лишь незначительно отличаясь друг от друга в структурном отношении, в большинстве случаев эти БАВ, выделенные ив многих видов морских огурцов и морских звезд, характеризуются столь же близким спектром биологической активности — цитостатическим, нейротропным, миотропным действием. При определении ингибирующего рост новообразований действия БАВ, выделенных из различных видов Echinodermata, это удается подтвердить.
Сапонины морских звезд — астеросапонины — имеют очень близкую к голотурину стероидную природу и наряду с ним характеризуются эквивалентными биологическими эффектами. Астеросапонины, как и голотурии, образуют при гидролизе стероидные генины, серную кислоту и различные моносахариды. Как правило, именно индивидуальные различия физико-химических характеристик и биологического действия отдельных сапонинов, выделенных из морских звезд и голотурий, основываются на различном качественном и количественном содержании остатков молекул. Так, астеросапонин А, выделенный из Aste- rias amurensis, Astropecten scoparius, Asterina pectinifera, Cos- cinasterial acutispina, образует при кислотном гидролизе стероидный гении, серную кислоту и по моносахариду — d-хиновозу и d-фукозу, а астеросапонин В — помимо указанных моноз еще -ксилозу и d-галактозу. Астеросапонины А, изолированные из хоокеанской морской звезды Pycnopodia helianthoides, харак
теризуются наличием уже других сахаров, в частности рамнозы. Сходная каотинз обнаружена при установлении структуры астеросапонинов Acterias forbesi, Patiria minata, Pisaster ochra- ceous и Pisaster brevispinus. При наличии общего стероидного генина, этерифицированного серной кислотой, они различаются моносахаридным составом углеводного компонента (Rio et al.,
- . В начале 60-х годов было высказано предположение (Glaureat et al., 1962), что цитостатическое действие стероидных сапонинов морских звезд и голотурий может объясняться их пенетрацией в клеточные мембраны быстро пролиферирующих клеток и образованием прочных комплексов с их липидами, в частности с холестерином, что ведет к структурным нарушениям мембран новообразующихся клеток.
Значительный ассортимент стероидных сапонинов с очевидным ингибирующим действием на рост и развитие некоторых видов злокачественных новообразований в вытяжках из морских звезд и голотурий привлекли внимание исследователей к этим группам гидробионтов. В процессе десятилетних экспериментально-поисковых работ исследователям Аризонского университета удалось обнаружить несколько видов морских огурцов, продуцирующих БАВ, характеризующихся высокой цитостати- ческой, антинеопластической активностью (Pettit et al., 1976). В частности, подобные БАВ, представляющие собой комплекс стероидных сапонинов ланостанового ряда, были выделены из голотурий Stichopus chloronotus Brandt (прибрежные зоны Австралии), Thelenota ananas jalger (район Тайваня и Маршальских островов) и Actinopyga mauritiana (побережье Гавайских островов). Выделенные из кювьеровых желез БАВ были названы соответственно стихостатином-1, теленостатином-1, ак- тиностатином-1. Стихостатин-1 получали из Stichopus chloronotus путем экстракции измельченных кювьеровых желез пропанолом и последующего противоточного распределения между бензолом и водой. Водная фаза экстрагируется 1-бутанолом, бутанольная фракция подвергается противоточному распределению (эфир—вода). После вымораживания водной фазы получают смесь стероидных сапонинов, очистка которых осуществляется на колонке с кремниевой кислотой (элюэнт—хлороформ—метанол,—вода; 20:5:0,5) с последующей перекристаллизацией из хлороформ—метанола. Стихостатин-1 образует из данной смеси игольчатые кристаллы с tnjI. 279—280°С. Молекулярный вес стихостатина-1, определенный осмометрически, равен 1200, эмпирическая формула €54-5бН93-98 0 27-28- Аналогичным образом получают ланостаниды: теленостатин-1 и актино- статин-1 из Thelenota ananas и Actinopyga mauritiana, образующих также игольчатой формы кристаллы с tra. 213—217°С и 218—220°С соответственно.
Изучение структуры выделенных из тихоокеанских голотурий сапонинов показало, что все они являются стероидами,
близкими по строению ранее описанным БАВ—голотоксину А, изолированному из морского огурца Stichopus japonicus Selenka, обладающего сильным противогрибковым действием, и голоту- рину А — из Actinopyga agassizi, обладающего цитостатическим действием. Подобно голотоксину стихостатин-1 не образует при гидролизе сульфат-ион, в то время как теленостатин-1 и акти- ностатин-1, как и голотурии А, содержат эфирносвязанную серную кислоту. Биологические испытания показали, что новым сапонинам, выделенным из трех тихоокеанских видов морских огурцов, свойственна сильная антинеопластическая активность за счет ингибирования внутриклеточного синтеза белка и рибонуклеиновой кислоты.
Лишь крайне незначительная часть иглокожих исследована на наличие БАВ и совсем ничтожная часть их — на наличие БАВ цитостатического действия. Поэтому можно ожидать открытия новых БАВ.— ингибиторов роста различных новообразований. В подтверждение приведенного соображения можно указать на факт обнаружения БАВ, обладающих выраженной антинеопластической активностью в экстрактах, полученных из большой группы ранее не обследованных на наличие БАВ видов иглокожих (Luidia clatrata, Astropecten, Scoparius, Pisaster ochraceous, Lytechinus variegalus). Их экстракты ингибируют развитие карциномы Уокера-256 и лейкемии L-1210 и RS (Pettit, Day, 1970).
Таким образом, целенаправленный поиск БАВ цитостатического действия среди продуктов метаболизма морских организмов имеет совсем еще краткую историю. Фактически начало первому научно обоснованному поиску «цитостатиков моря» было положено только в 1966 г. в связи с утверждением National Sea Grant Programm. С этого времени и ведет свое начало планомерное изучение гидробионтов на наличие БАВ, в том числе и цитостатического действия. Открытию новых БАВ, обладающих ингибирующих действием на рост быстро пролиферирующих тканей, в значительной степени способствовала разработка новых методов фармакологического скрининга цитостатиков и новых тест-культур и методов. Используя новые технологические приемы получения нативных вытяжек из тканей гидробионтов и новые объекты исследования, ученым удалось расширить ассортимент изучаемых объектов. Среди наиболее перспективных продуцентов БАВ цитостатического действия были открыты различные виды рыб, моллюсков, губок и особенно кишечнополостных. Подлинной удачей следует считать открытие цитостатического действия палитоксина — вещества, в ничтожных дозах (5 нг/кг) тормозящего рост малигнизированных клеток. Интенсивное изучение 'биологии размножения, дифференциации пола у кишечнополостных и роста в последние годы позволило выяснить физиологические механизмы действия палитоксина — сильнейшего регулятора половой функции
самых низших животных организмов моря, а вместе с тем указало на один из наиболее плодотворных путей поиска новых БАБ, способных регулировать клеточное деление и дифференциацию, что привело к открытию новых видов полипов—продуцентов палитоксиноподобных веществ, способных воздействовать на более широкий спектр злокачественных новообразований. Наряду с палитоксином другие виды коралловых полипов, очевидно, используют аналогичный механизм контроля половой активности и клеточной дифференциации, вырабатывая, что нельзя исключить, иной природы химические соединения. Наличие палитоксина установлено всего у нескольких видов коралловых полипов, однако даже и среди этих продуцентов БАБ, ответственные за рост и развитие организмов, в значительной мере различаются спектром цитостатического действия и токсичности. Что же можно сказать о биопродукции остальных почти 6000 видов коралловых полипов, исследование которых на наличие БАБ цитостатического действия в абсолютном большинстве случаев еще не начато?
Это в полной мере относится и к другим таксономическим единицам — морским звездам, морским огурцам, рыбам, из тканей которых выделены потенциально интересные БАБ, и, конечно же, к моллюскам, насчитывающим свыше 100 000 различных видов. Изучение всех групп морских организмов на наличие БАБ вообще, в том числе и цитостатического действия, только-только началось. И можно с уверенностью ожидать, что в процессе исследования будут открыты совершенно новые соединения, а вместе с ними и новые методы воздействия на рост быстропролиферирующих тканей (И. С. Ажгихин с соавт., 1977).
Большой интерес представляет изучение химической структуры БАБ морских организмов, анализ которой позволяет в ряде случаев синтезировать аналоги природных и синтетических цнтостатиков. Так было в случае с нуклеозидами карибской губки Cryptotethya crypta: созданные на их основе цитидин- арабинозиды прочно вошли в арсенал наиболее эффективных современных средств химиотерапии лейкозов. Во многих случаях БАБ гидробионтов характеризуются наличием оригинального химического строения и обладают нередко необычайно выраженным физиологическим действием. Можно предположить, что после выяснения структуры соединений типа палитоксина следует ожидать синтеза его аналогов, лишенных побочных, нежелательных действий. Во всех случаях , когда БАБ гидробионтов вообще может представить практический интерес, его модификация и дальнейшая судьба будут тесно связаны с синтетической химией (И. С. Ажгихин с соавт., 1977).
Морские организмы представляют большой интерес не только как источники специфических БАБ цитостатического действия, но и как колоссальный источник для получения основно
го компонента универсального механизма контроля клеточного деления — келонов. Будучи тканеспецифическими, эти белковые субстанции не обладают видовой с