Разработки холерной вакцины, интенсивно проводившие­ся в 1970—1980 гг., не увенчались успехом, несмотря на ис­пользование разных принципов конструирования: живая вак­цина, убитая цельноклеточная вакцина (корпускулярная), молекулярная (химическая), ферментная, комплексная (цель­ноклеточная убитая, обогащенная очищенными антигенами, синтетическая и искусственноклеточная) [Адамов А.К., 1980; Адамов А.К. и др., 1984, 1988]. По-видимому, этим обстоя­тельством объясняется продолжающееся и в настоящее время использование уже достаточно изученных ранее вариантов состава вакцин наряду с поисками принципиально новых технологических решений.
Живые вакцины относятся к вакцинам первого поколения, принципы разработки которых были заложены Л.Пастером. Первая живая холерная вакцина представляла собою жидкую культуру холерных вибрионов с искусственно сниженной при ее выращивании вирулентностью. В последующие годы подоб­ные вакцины разрабатывались Д.К.Заболотным (1893), В.Хав­киным (1906) и Н.К.Верениновой и соавт. (1958—1959) в институте «Микроб». Несколько лет спустя S.Mukerjee (1963) выделил из объектов окружающей среды авирулентные штам­мы холерных вибрионов, которые рекомендовал использовать в качестве живой вакцины.
В институте «Микроб» из штамма Эль-Тор серовара Инаба был селекционирован авирулентный штамм 118В серовара Инаба, который в опытах на животных проявлял высокую иммуногенность, особенно в смеси со штаммом GW-6 [Пет­рова Л.С. и др., 1972; Адамов А.К. и др., 1973; Адамов А.К. и др., 1983; Шмеркевич Д.Л. и др., 1985].
В опытах на животных были получены авирулентные и иммуногенные штаммы холерных вибрионов [Joo J., 1974; Finkeistein R.A. et al., 1974—1982; Honda J., Finkeistein R.A. 1982]. Вакцинный штамм T.Honda и R.A.Finkelstein (1979), названный ими “Звезда Техаса”, относится к биовару Эль- Тор серовара Огава. Он продуцирует в достаточно большом количестве не экзотоксин, а его нетоксичную субъединицу В. Тем не менее у 20 % добровольцев этот штамм вызывает диарею [Levin М.М. et al., 1981, 1984].
Исследования штаммов, выделенных из кишечника чело­века, окружающей среды или полученных с помощью генети­ческих приемов холерных вибрионов 01 серовара [Kaper J.B., Levin М.М., 1981; Levin М.М. et al., 1982; Mekalanos J.J. et al., 1982], которые не содержали гена холерного экзотоксина (ХТ-), показало, что у ^!/з привитых ими перорально людей развивается диарея [Levin М.М., 1986]. J.В.Kaper и соавт. (1984, 1989), М.М.Levin и соавт. (1988, 1988а) с помощью рекомби­нантной генноинженерной технологии получили вакцинный штамм холерного вибриона CVD ЮЗ-HgR, синтезирующий субъединицу В холерного экзотоксина, который при перо­ральной иммунизации людей [Migasena et al., 1989] вызывал накопление антител в крови. Разрабатываются и другие ре­комбинантные вакцины [Мотин В.Л. и др., 1988; Смирнова Н.И. и др., 1988, 1989; Imamoto Т., 1988; Dougan G. et al., 1988; Stelszner A. et al., 1989].
Согласно данным N.F.Pierce и соавт. (1984—1987), иммуно­генность штаммов холерных вибрионов не связана с наличием в клетках А⁺ и В⁺ генов vet. Она обусловлена способностью штаммов адгезироваться к энтероцитам и приживаться в ки­шечнике. Тем не менее подвижность муциназы и токсина, вероятно, способствует адгезии штаммов вибрионов к энтеро­цитам [Асташкин Е.И. и др., 1985; Pierce N.F. et al., 1985, и др.]. По данным Р.А.М.Guinee и соавт. (1987), напряженный иммунитет к холерным вибрионам при пероральной иммуни­зации вызывают только вакцинные штаммы, имеющие в клет­ках А⁺ и В⁺ гены vet.
Н.Fujisawa и соавт. (1987) в сравнительных опытах на мы- шатах-сосунках линии BALBC установили, что при перораль­ном введении живые холерные вибрионы вызывают более напряженный иммунитет, чем убитые нагреванием вибрионы. Очищение мышей от вибрионов после повторного заражения происходило быстрее у иммунизированных живыми вибрио­
нами животных, чем у иммунизированных убитыми вибрио­нами.
По наблюдениям М.Е.Иегсе и соавт. (1988), иммуноген- ность живых вакцин зависит в основном от свойства колони­зировать кишечник. Вакцины, слабо приживающиеся в ки­шечнике, не иммуногенны.
Используя методы генной инженерии, Джакоб (1988) ввел в авирулентный штамм сальмонеллы ген СТР-3, кодирующий синтез фрагмента СТР50—60 субъединицы В холерного экзо­токсина. В гибридном штамме ген экспрессировался в виде гибрида с флагеллином. В.О.РоггеБ! и соавт. (1989) получили гибридную холерную живую вакцину ЕХ 645 путем введения в авирулентный штамм ^ДурЫ гена 21а, контролирующего синтез О-антигена холерного вибриона. При пероральном введении добровольцам эта вакцина вызывала иммунологи­ческую перестройку, сопровождавшуюся накоплением в кро­ви специфических антител. По данным С.О.Таскег и соавт. (1990), вакцина вызывала у добровольцев образование имму­нитета, обеспечивающего защиту только 25 % привитых, но авторы считают ее перспективной. С).-1.Ма и соавт. (1990) с помощью рекомбинантной плазмиды рММ-СТВ, несущей ген субъединицы В холерного экзотоксина, получил штамм Ту 21а (рММ-СТВ), продуцирующий субъединицу В. На основе это­го штамма они сконструировали вакцину, состоящую из кле­ток Ту 21а (рММ-СТВ) и убитых клеток вибрионов, которая обладала иммуногенностью.
Вакцинные штаммы холерных вибрионов, полученные раз­ными способами, не применяются в медицинской практике вследствие токсигенности их для людей, опасности полной реверсии вирулентности и недостаточной иммуногенности.
К вакцинам второго поколения относятся убитые корпус­кулярные вакцины, комплексные вакцины, молекулярные вакцины (химические вакцины). Основы конструирования этих вакцин заложены Н.Ф.Гамалея (1888) и \V.Kolle (1896). Со­вершенствование вакцин второго поколения не увенчалось значительными успехами, но позволило создать убитые кор­пускулярные холерные вакцины, широко применявшиеся в практике и обеспечивающие 50—60 % защиту [Олли В.Д., Петрова Л.С., 1960; Караева Л.Т. и др., 1966, 1968; Лавровская
В.М., 1969; .1оо Т, 1974].
Холерную ассоциированную вакцину, состоящую из уби­тых клеток вибрионов и живой чумной вакцины, разработали
Е.И.Коробкова и соавт. (1958).
Л.Т. Караева и соавт. (1971) для повышения иммуногенности убитой корпускулярной холерной вакцины предложили добав­лять в нее очищенный антиген Ватанабе. Более иммуногенной в опытах на животных оказалась вакцина, ассоциированная с вакциной брюшного тифа [Караева Л.Т. и др., 1975—1979].
Для парентерального применения J.S.Saroso и соавт. (1978),
J.Joo и Z.Csizer (1978) разработали вакцину, состоящую из убитых клеток холерных вибрионов, сорбированных на гидро­окиси аммония. В полевых условиях эта вакцина у детей до 5 лет обеспечивала в течение 6 мес 100 % защиту, через 12 мес после прививки — 88,9 %, у взрослых через 6 мес — 60 % [Pal S.C. et al., 1980].
Ciufecu и соавт. (1980) разработали для внутрикожной иммунизации новую корпускулярную вакцину, содержащую убитые нагреванием клетки холерных вибрионов.
Убитую корпускулярную вакцину, состоявшую из клеток вибрионов холерного токсоида, для подкожной иммунизации в 1973—1987 гг. разработали А.К.Адамов и соавт. (1990). Вакци­на обладала высокой иммуногенностью. Эти данные были подтверждены I.W.Peterson (1979).
Убитые корпускулярные вакцины при парентеральном вве­дении вызывали накопление в крови агглютининов, вибрио- цидинов и антигемолизинов, а также секреторных антител в кишечном секрете и слюне [Адамов А.К., 1980; Hohu-Zoric М. et al., 1989].
Вакцина для перорального применения, содержавшая уби­тые клетки холерных вибрионов 3 штаммов и холероген-ана- токсин, была предложена А.К.Адамовым и А.И.Волосивец (1973) и широко испытана на животных и добровольцах. Эксперименты на кроликах показали, что после внутрижелу- дочного введения этой вакцины у них возникал иммунитет, защищавший от заражения холерными вибрионами в лигиро­ванные петли тонкой кишки [Адамов А.К. и др., 1973, 1983, 1991; Волосивец А.И. и др., 1976; Волосивец А.И., Адамов А.К., 1979].
Вакцины, состоявшие из убитых клеток холерных вибрио­нов и токсоида, разрабатывались J.W.Peterson (1979), Z.Kudelski и A.Zahraewska (1986).
В Советском Союзе для производства холерного анатоксина и химических вакцин использовался штамм V.cholerae cholerae 569В серовара Инаба линии “НА”, продуцирующий большое количество экзотоксина в простой среде, содержащей гидро­лизат казеина и пептон. Этот штамм М.С.Наумшина и А.К.­Адамов (1969) селекционировали из штамма V.cholerae cholerae 569В серовара Инаба, широко применяемого за рубежом в качестве продуцента экзотоксина. В последние годы найдены штаммы — продуценты экзотоксина среди диких штаммов [Авроров В.П. и др., 1987; Смирнова Н.И. и др., 1989, 1990] и получены с помощью генной инженерии штаммы — про­дуценты холерного экзотоксина [Смирнова Н.И. и др., 1989] и штаммы — продуценты субъединицы В [Honda Т., Finkelstein R.A., 1979; Sanchez J., Holmgren J., 1989, и др.].
С целью повышения иммунной эффективности холерных вакцин предлагались комбинированные парентерально-энте­ральные способы иммунизации [Адамов А.К. и др., 1974; Denchev V. et al., 1974; Peterson J.W., 1979, и др.].
J.Holmgren и A.N.Svennerholm (1983) предложили вакци­ну, состоящую из убитых клеток вибрионов и субъединицы В холерного токсина. В течение последующих лет авторы изучи­ли ее эффективность в лабораторных условиях и полевых испытаниях [Black В.Е. et al., 1987; Gertborn М. et al., 1984— 1988; Glemens J.D. et al., 1986—1989; Migasena M. et al., 1989]. По данным M.Migasena и соавт. (1989), вакцина, состоявшая из 2-1011 убитых клеток вибрионов и 5 мг субъединицы В, была более иммуногенна, чем вакцина, содержащая меньшее количество компонентов. J.D.Clemens и соавт. (1990) проводи­ли полевые испытания вакцины, состоявшей из убитых виб­рионов и субъединицы В. Защита от заболевания холерой не превышала 60 %.
Химическая вакцина, возможность конструирования кото­рой впервые показана Н.Ф.Гамалеей (1888), была разработана Н.Е.Гефен (1943). Вакцина применялась для профилактичес­кой иммунизации населения, но вследствие недостаточной иммуногенности производство ее прекратили [Крестовнико- ва В.А., 1956].
После подтверждения данных И.И.Мечникова о существо­вании холерного экзотоксина [De S.N. et al., 1959; Dutta N.K. et al., 1959], обнаружения штамма — продуцента экзотоксина и разработки методики получения анатоксина [Craig J.P., 1966; Sack R. et al., 1966; Saletti M., Ricci A., 1974, и др.] большин­ство исследователей считали, что проблема конструирования вакцин будет решена в ближайшие годы путем получения высокоочищенного холерного анатоксина [Finkeistein R.A., 1965, 1970; Burrows W. et al., 1971; Holmgren J. et al., 1972]. В экспериментах на животных некоторыми исследователями были получены обнадеживающие результаты [Craig J.P., 1966; Burrows W. et al., 1971; Fudjita K., Finkeistein R.A., 1972, и др.]. Тем не менее более четко поставленные эксперименты на животных [Адамов А.К. и др., 1969—1973; Srivastava R. et al., 1979], а также наблюдения на добровольцах [Homick R.B. et al., 1972; Gash R. et al., 1974; Levine M.M. et al., 1979] и полевые испытания [Комитет экспертов ВОЗ, 1979—1980; Finkeistein R.A., 1979] показали, что химическая вакцина, содержащая холероген-анатоксин, не вызывает эффективного иммунитета к холере.
Впервые химическую холерную вакцину для парентераль­ного введения, состоящую из анатоксина, О-антигенов Инаба и Огава, разработали М.Н. Джапаридзе и соавт. (1972, 1974). Вакцина после комиссионных испытаний была внедрена в практику здравоохранения СССР, но противоэпидемическая эффективность ее не изучена [Джапаридзе М.Н. и др., 1974— 1985; Сумароков А.А. и др., 1974—1978; Караева Л.Т., 1977, 1978].
Технология производства вакцин постоянно совершенству­ется [Эмдина И.А. и др., 1987; Владимцева И.В. и др., 1988; Алексеева А.Л. и др., 1988; Бурлакова О.С. и др., 1989; Сла­вянская Т.А. и др., 1989; Лобанов В.В. и др., 1988; Нечецкая Р.М. и др., 1988; Мелещенко М.В., Джапаридзе М.Н., 1989; Щуковская Т.Н. и др., 1989; Ермакова Г.В. и др., 1989; Кос­тина Г.И. и др., 1989].
Н.Е.Гефен и соавт. (1970, 1972), Е.Липкин и соавт. (1970) в качестве холерной вакцины предложили смесь холерного экзотоксина с О-антигенами, сорбированными на трехзаме- щенном фосфате кальция. Препарат обладал недостаточной иммуногенностью.
Холерную химическую вакцину для перорального приме­нения впервые разработали В.Н.Космодамианский и А.И.Бе­лоусова (1925).
Химическую вакцину для пероральной иммунизации на основе холерного анатоксина разрабатывали В.В.Лобанов и
С.М.Рассудов (1973), М.Н.Джапаридзе и соавт. (1976), Тч1.Е.Р1егсе и соавт. (1983). Завершаются испытания таблетиро- ванной холерной химической вакцины для перорального при­менения [Джапаридзе М.Н. и др., 1979—1990].
Г.И.Костина и М.В.Сидорова (1987) разрабатывают перо­ральную холерную вакцину на основе субъединицы В токсина.
Ю.Г.Резник и соавт. (1980) показали, что препарат, состо­ящий из смеси неочищенных компонентов жгутиков холерных вибрионов и анатоксина, вызывает напряженный иммунитет, обеспечивающий защиту животных при заражении их в лиги­рованные петли тонкой кишки.
По данным Р.Б.Манахилова и соавт. (1986), эффективность иммунизации химической вакциной возрастает при комбини­рованном подкожно-пероральном ее применении.
Под руководством Додена (1978—1980) во Франции разра­батывалась химическая таблетированная вакцина, представля­ющая собой фрагменты наружной мембраны клеток холерных вибрионов, экстрагируемые трихлоруксусной кислотой, или посредством колоночной хроматографии, или с помощью ультрафильтрации. Эта вакцина была испытана в Заире в 1983— 1984 гг. с положительным результатом: из 12 014 привитых людей заболели холерой 6 человек (0,05 %), в то время как в контрольных группах из 6249 привитых парентерально лю­дей заболели 57 человек (0,91 %) и из 18 377 получивших плацебо — 216 человек (1,17 %). Авторы отмечают, что это предварительные данные [Мазег^о В., 1984].
Вакцины третьего поколения — синтетические вакцины, основанные на использовании антигенных фрагментов, со­держащих только антигенные детерминанты, начали разраба­тывать зарубежные [Carlson Н.Е. et al., 1977; Svenson S.B. et al. 1977, 1979; Audibert F. et al., 1981, 1981a, 1982; Bulinski J.Ch., 1983, 1986] и советские исследователи [Петров Р.В., Хаитов Р.М., 1978; Кабанов В.А., 1987].
Антигенные фрагменты могут быть выделены из нативных молекул возбудителей инфекций [Свенсон и др., 1977—1981; Кабанов, 1984] или синтезированы искусственно [Села М. и др., 1984; Carlson Н.Е. et al., 1977; Audibert F. et al., 1981, 1981a; Jacob Ch.O. et al., 1983]. Как правило, они иммуногенны с адъювантами. Показана возможность использования в качестве адъювантов фрагментов, выделенных из нативных молекул микобактерий, полных антигенов сальмонелл [Adam A. et al., 1976] и синтетических веществ [Кабанов В.А., 1984; Села М., 1984; Свиридов Б.Д. и др., 1986; Merger С. et al., 1975].
S.B.Svenson и соавт. (1979) установили, что из очищенных препаратов порина сальмонелл и октасахарида сальмонелл с помощью химических методов могут быть получены крупно­молекулярные полимеры, обладающие иммуногенностью.
C.O.Jacob и соавт. (1983) синтезировали небольшие пепти­ды: СТР8-20; СТРЗО-42; СТР69-85; СТР75-85; СТР50-64; СТР83-97, соответствующие определенным участкам пептид­ной цепи субъединицы В холерного экзотоксина. Этими пеп­тидами, ковалентно связанными с молекулами тетанотоксина (в качестве носителей), иммунизировали животных. Сыворот­ка против пептида СТР50—60 нейтрализовала холерный экзо­токсин в кожной пробе и в лигированной петле тонкой киш­ки кролика [Jacob С.О. et al., 1983, 1986, 1988; Pedoussant S. et al., 1989].
Разработка синтетической холерной вакцины, несомнен­но, актуальна. Исследования в этом направлении только на­чаты как в России, так и в зарубежных лабораториях.
Вакцины четвертого поколения — искусственноклеточные вакцины, научно обоснованные А.К.Адамовым (1975), пред­ставляют собою искусственные капсулы или протопластопо­добные частицы на синтетических или биологических полиме­рах, содержащие структурные антигены, анатоксины, фер­менты и адъюванты в оптимальных соотношениях. В качестве антигенов при производстве искусственноклеточных вакцин могут использоваться синтетические вакцины. Искусственно­клеточные вакцины лишены недостатков, имеющихся у жи­вых вакцин, и обладают преимуществами живых и искус­ственных вакцин. В экспериментах было установлено, что ис­кусственные клетки, содержащие структурные антигены и фер­менты, более иммуногенны, чем эти же компоненты, вводимые животным в виде раствора, так как искусственная клетка действует на клетку иммунной системы макроорганизма одно­временно комплексом разных антигенов, имитируя действие патогенного микроба.
При конструировании искусственноклеточных вакцин воз­можно применение следующих способов: 1) заключение ан­тигенов и ферментов в искусственные протопласты, форми­руемые путем коацервации или полимеризации из природных или синтетических полимеров; 2) микрокапсулирование с использованием природных или синтетических полимеров; 3) микрокапсулирование с образованием липосом, содержа­щих антигены и ферменты [Адамов А.К., 1975, 1981; Ост­ро М.Д., 1987; Richards R.L. et al., 1980].
Для приготовления искусственных клеток предложены раз­личные композиции, включающие дезоксихолат, липид и некоторые другие комплексы [Herrman S.H., Mescher М.Е., 1981]; поли-2-гидроксиэтилметакрилат [Торчилин В.П., Смир­нов С.П., 1984; Ronel S.H. et al., 1983, и др.]; лектин и холе­стерин [Mateligia Т.М., Motas С., 1986]; полиакриловый крах­мал и некоторые другие компоненты [Arturson Р. et al., 1986]. Введение в искусственные клетки некоторых ферментов адре­сует их в определенные ткани организма [Ротман Д.Э., 1985].
А.К. Адамов и Н.Г. Тихонов (1974) показали, что искусст­венноклеточные препараты, представляющие собой холерный О-антиген, заключенный в желатиновые протопласты, обла­дают более высокой иммуногенностью, чем растворимые ан­тигены. Согласно сообщениям N.F. Pierce и соавт. (1984), Н.И. Нарбутович и соавт. (1985), холерный экзотоксин в ли- посомах более иммуногенен, чем в растворенном состоянии.
Искусственноклеточные вакцины находятся в начальной стадии разработок. Полученные результаты исследований по­зволяют признать конструирование искусственноклеточной вак­цины главным направлением в разработке холерных вакцин.