Лабораторная иммунодиагностика до сих пор находится в периоде становления. Первоначально иммунологические тесты использовали (и достаточно широко) для диагностики инфекционных заболеваний, аллергопатологии, а также для типирования групп крови и тканевой совместимости. В 70-е годы прошлого века стали широко распространяться лабораторные методы характеристики популяций и субпопуляций лимфоцитов, а также определения концентарции сывороточных иммуноглобулинов и других гуморальных факторов, значимых с иммунологической точки зрения. Поводом для оценки этих показателей было желание оценить состояние иммунной системы больных (в типичных случаях — выявление иммунодефицитных состояний), а не диагностика активных иммунопатологических или инфекционных процессов, как это было ранее.
Ключевым событием, ускорившим прогресс в данной области, стала разработка простого подхода к выделению лимфоцитов (в связи с возможностью примесей выделяемые клетки обычно называют мононукле- арами), основанного на центрифугировании порций крови на слое смеси полисахарида фиколла и радиоконтрастного вещества верографина (другие наименования — гипак, пак); при этом эритроциты и сегментоядерные клетки, а также большинство моноцитов проходят этот слой и оседают на дно пробирки, а лимфоциты с примесью дендритных клеток и моноцитов формируют кольцо над плотным слоем фиколла-верографина. Арсенал средств и методов, первоначально использовавшихся для характеристики клеток иммунной системы (методы, основанные на розеткообразовании и т.д.), с современных позиций выглядит неадекватным. Только создание гибридомной технологии и появление моноклональных антител, а затем и соответствующей приборной базы для выявления их связывания с клетками, позволило разработать адекватные подходы для идентификации клеток. Пока не создано четких стандартных подходов для всесторонней функциональной характерики клеток иммунной системы и опосредуемых ими процессов. Не меньшей проблемой является способность врачей, занимающихся иммунодиагностикой, дать адекватную трактовку полученным результатам. Безусловной издержкой процесса внедрения иммундиагнос- тических методов в практическую медицину является их избыточное применение (характерное только для практики отечественной клинической иммунологии). Так, в соответствии с документами Всемирной организации здравоохранения, иммунофенотипирование клеток иммунной системы рекомендуется осуществлять только для диагностики СПИДа, первичных иммунодефицитов и лимфопролифератвиных заболеваний. Между тем в отечественной практике определение иммунного статуса стало почти столь же универсальным диагностическим подходом, как клинические анализы крови и мочи, с несопоставимо более низкой информативностью.
Важная тенденция, характеризующая динамику методической базы иммунодиагностики, — переход от разнообразных по принципам, лежащим в их основе, слабоавтоматизированных и субъективных методов к комплексу высокостандартизированных подходов, сводимых к малому числу базисных технологических принципов. Так, в настоящее время иммунологические методы, используемые в клинической иммунологии, основаны почти исключительно на двух методических подходах: при определении гуморальных факторов — на иммуноферментном анализе, а при изучении клеток — на проточной лазерной цитофлуорометрии.
Метод иммуноферментного анализа имеет серьезную теоретическую базу и достаточно совершенное инструментальное оснащение. В настоящее время используют практически исключительно твердофазный вариант метода (ELISA — Enzyme-linked immunosorbent assay). Его применяют в двух основных вариантах — конкурентном и двусайтовом. Конкурентный вариант обычно используют для определения антител к известным антигенам. В его основе лежит конкуренция за связывание с сорбированным антигеном меченых и немеченых (определяемых) антител: мерой концентрации оцениваемых антител служит степень подавления связывания меченых антител по сравнению с контролем, в котором конкурентные антитела заведомо отсутствуют. В качестве метки антител используют ферменты, чаще всего перокисдазу или щелочную фосфатазу, которые затем выявляют с помощью хромогенных субстратов. Двусайтовый вариант реакции обычно используют для определения антигена. Он основан на том, что антиген практически всегда несет более одного типа эпитопов. На пластиковую поверхность фиксируют антитела против одного эпитопа изучаемого антигена. Затем позволяют антигену связаться с этими антителами и наслаивают антитела, направленные против другого эпитопа («вторые антитела»). Связывание этих антител регистрируют с помощью антиизотипических антител, меченых пероксидазой или иными ферментами. В настоящее время с целью повышения чувствительности и стандартности все чаще вторые антитела метят стрептавидином, связывание которого затем выявляется с помощью биотина, конъюгированного с ферментом. Концентрация антигена (или второго антитела — в случае определения антител) пропорциональна связыванию ферментативной метки.
Метод проточной цитофлуорометрии зародился благодаря созданию прибора — лазерного проточного цитофлуориметра, позволяющего регистрировать с помощью лазерного луча параметры клеток, походящих через капилляр. Параметры регистрируются автоматически и подвергаются компьютерной обработке, результаты которой визуализируются в виде графиков. Метод позволяет исследовать параметры, основанные на светорассеянии — прямом (размер клетки) и боковом (зернистость). На основании этих параметров строится двумерное распределение клеток, в котором может быть задана область (соответстующая клеткам конкретных типов, локализация которых в этом «поле» известна). Дальнейший анализ строится на выявлении связанных с клетками флуоресцентных красителей. Красителями метят моноклональные антитела или иные реагенты, позволяющие определять маркерные молекулы на поверхности клетки (а при дополнительной обработке клеток — и внутри нее). В зависимости от числа лазеров, которым снабжен прибор, варьирует число дифференцируемых цветов (в современных приборах gt;10). Метод позволяет идентифицировать различные типы клеток, оценить плотность экспрессии маркера и другие многочисленные параметры. На этом же принципе основано фракционирование клеток, экспрессирующих определенные молекулы.
В последнее время для определения иммунологически значимых факторов, в том числе при иммунодиагностике, все чаще стали прибегать к использованию методов молекулярной биологии, в первую очередь полимеразной цепной реакции. Наиболее широкое применение получил метод качественной ПЦР при типировнаии HLA, особенно II класса. Однако все большее распространение получает количественный вариант полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией, что позволяет оценить уровень экспрессии генов, в том числе кодирующих иммунологически значимые молекулы.
Методы, позволяющие оценивать функцию клеток, более разнообразны и значительно слабее стандартизированы. Пока они только частично могут быть вписаны в охарактеризованные выше лабораторные технологии.
Подходы к оценке состояния врожденного и адаптивного иммунитета заметно различаются.