Явления электронного парамагнитного резонанса заключается в резонансном поглощении энергии электромагнитного излучения в радиочастотном диапазоне частицами парамагнитного вещества при действии на него постоянного магнитного поля. Установлено, что неспаренные электроны содержат большое количество биологически активных веществ, которые обладают парамагнитными свойствами. Следовательно, их участие в биохимических реакциях и их состояние может быть исследовано методом ЭПР.
Каждый неспаренный электрон обладает магнитным моментом, связанным со спином. Спином называют собственный момент количества движения электрона вокруг оси вращения. При наложении магнитного поля (H) неспаренные электроны распределяются по двум различным энергетичес
ким уровням с антипараллельным направлением спина. Поскольку не все вещества содержат собственно парамагнитные центры, то для получения возможности их исследовать методом ЭПР такие центры стали вводить извне и называть спиновыми зондами или метками, а саму указанную технику

• методом спинового зонда или спиновой метки. Спиновыми метками можно считать нитроксильные радикалы, ковалентными связями химически прочно связанные с биологически активными молекулами. Если имеется лишь физическое взаимодействие с исследуемыми молекулами, то такие радикалы носят название спиновых зондов.

Электроны двух различных энергетических уровней будут обладать различной энергией, так как при ориентации магнитного момента параллельно магнитному полю энергия взаимодействия уменьшается, а при ориентации внешнего магнитного поля происходит расщепление энергетических уровней. Если на объект, содержащий неспаренные электроны, помещенный в сильное однородное магнитное поле (H=3000 эрстед), подать электромагнитное излучение такой заданной частоты, чтобы квант энергии hv был равен разности между двумя энергетическими уровнями обеих групп, то это и будет так называемой резонансной частотой. За счет энергии излучения неспаренные электроны, находящиеся на низком энергетическом уровне, переходят на более высокий с одновременным изменением направления спина. Это поглощение энергии электронами может быть обнаружено по изменению мощности электромагнитного излучения, проходящего через систему, и зарегистрировано каким-либо способом, принятым в абсорбционной радиоспектрометрии.
Спектры ЭПР характеризуются тремя основными параметрами: интегральной интенсивностью, шириной линии и др., g- фактором спектроскопического расщепления. Вещества, содержащие неспаренные электроны, поглощают падающее на них микроволновое излучение, которое пропорционально разнице “заселенности” энергетических уровней. При определенных условиях величина поглощения электронов зависит от их количества, что позволяет судить о концентрации неспаренных электронов в образце. Две линии поглощения с одной и той же интегральной интенсивностью могут иметь совершенно разную форму: одна может быть пологой и “раз
мазанной”, другая - узкой и ассиметричной. Таким образом, ширина линии является дополнительным параметром, характеризующим условия поглощения. Существует два вида взаимодействия электронов, оказывающих на уширение резонансной линии определенное влияние. Ими являются спин-ре- шеточное и спин-спиновое взаимодействие. Ширина линии непосредственно определяется разницей между энергетическими уровнями, занимаемых неспаренными электронами и, следовательно, позволяет судить о реальных взаимодействиях электронов, которые приводят к неизбежному “размазыванию” линии. Другим важным параметром, характеризующим линию поглощения, является положение точки максимального поглощения. Исходя из формулы (1):
hv = gbH ,              (2)
очевидно, что если микроволновая частота поддерживается постоянной, то единственными параметрами, которые могут изменять условия резонанса (1), являются напряженность приложенного извне магнитного поля (H) и величина g-фактора. Следовательно, значение поля, при котором имеет место резонанс, определяет величину g-фактора для данного свободного неспаренного электрона или неспаренного электрона, связанного с атомом или молекулой. Теоретически доказано, что величина g-фактора свободного неспаренного электрона равна 2,0023. Во многих свободных радикалах, у которых неспаренный электрон вращается по сильно делокализо- ванным орбиталям, значения g-фактора очень близки к этой величине, что указывает на очень слабую связь спинового и орбитального моментов. Если же неспаренный электрон связан с каким-либо атомом или молекулой сильно, то значения g- фактора будут отличаться от значений g-фактора свободного электрона. Измеряя величину g-фактора, можно получать подробную информацию о характере внутримолекулярных связей.
Описанные выше три основных параметра, характеризующие линии поглощения ЭПР-спектров, применимы, в основном, для синглетных линий.
Большинство же исследований, дающих возможность получения более детальной информации как об энергетическом состоянии неспаренных электронов, так и об их локализации, основано на явлении расщепления линий поглощения.
Существуют два основных типа расщепления, характерных для ЭПР. Оба они важны для исследования биологических объектов. Первое - тонкое (“электронное”) расщепление, возникает в тех случаях, когда изучаемая молекула или атом обладают не одним, а несколькими неспаренными электронами; второе - сверхтонкое расщепление наблюдается при взаимодействии неспаренных электронов с магнитным моментов ядер, находящихся в пределах его орбитали.
Неспаренный электрон NO-группы зонда находится на 2р- орбитали. Наличие спинового момента у электрона приводит к воздействию магнитного момента, среднее значение которого определяется:

(3)
где S - вектор спинового углового момента электрона; g - фактор спектроскопического расщепления; b - магнетон Бора.
Если приложить постоянное магнитное поле H извне, то оно взаимодействует с магнитным моментом электрона. Энергия этого взаимодействия описывается Гамильтонианом:

(4)
Согласно квантовой теории, ориентации спина электрона квантованы, т.е. его проекции на любое направление, которое задается внешним магнитным полем, могут иметь только дискретные значения. Если принять направление поля H за ось Z лабораторной системы координат, то ось Z в этом случае будет являться направлением квантования электронного спина S. Каждой проекции спина соответствует определенное значение энергии. Тогда, принимая во внимание формулы, имеем:

(5)

(6)
Под действием переменного магнитного поля, перпендикулярного полю H, между верхним и нижним энергетическими уровнями, будут наблюдаться переходы, сопровождающиеся переориентацией электронного спина. При этом частота переменного магнитного поля должна соответствовать энергии перехода:
(7)
(8)
где h - постоянная Планка, р - магнетон Бора.
Последнее уравнение определяет условие парамагнитного резонанса. Вероятность индуцированных переходов с нижнего уровня на верхний и, наоборот, равны. Однако, поглощение микроволн в исследуемых препаратах все же имеет место. Это объясняется тем, что в условиях термодинамического равновесия на нижнем уровне, в соответствии с распределением Больцмана, всегда находится больше электронов, чем на верхнем. Микроволновое излучение стремится выровнять населенности энергетических уровней, но этому препятствуют безизлучательные переходы электронов на нижние уровни, которые передают свою энергию тепловым колебаниям решетки (спин-решеточная релаксация), а также взаимодействия электронов, посредством которых их спины обмениваются энергией (спин-спиновая релаксация). В обоих случаях происходит уменьшение жизни спиновых состояний, что приводит к уширению линии резонансного поглощения.
В нитроксильных радикалах электронный спин по диполь- дипольному механизму эффективно реагирует с ядерным спином азота J=1, проекция которого на ось квантования, задающей направление внешнего магнитного поля, определяется соответствующими величинами магнитных квантовых чисел ^,1=±,0. В этом случае с магнитным моментом электрона будут взаимодействовать еще три локальных магнитных поля. Энергия такого сверхтонкого взаимодействия (СТВ) характеризуется анизотропной константой, которая зависит от направления внешнего магнитного поля, относительно NO-группы
радикала. Это приводит к появлению трех линий разрешенных электронов переходов, что определяет расщепление линий резонансного поглощения (рис. 2).
Таким образом, в спектрах ЭПР нитроксильных радикалов вместо одной линии поглощения возникают три линии равной интенсивности, соответствующие различным ориентациям ядерного спина азота.

Рис. 2. (пояснение в тексте)
Существуют способы, позволяющие по соотношению ширины этих трех линий, по положению на оси напряженности магнитного поля и по зависимости от мощности микроволнового излучения рассчитывать времена корреляции меток в пределах от 10-11 до 10-13 с. В случаях, когда метка связана с белком не жестко, изменение времени корреляции NO-группы может отражать изменение конформации белка в области присоединения метки.
Исследование реакции скорости восстановления нитроксильных радикалов в нативных тканях имеет значительные трудности для дальнейшей расшифровки данных. Поэтому для проведения исследований подобного рода чаще применяют искусственно созданные среды. Аскорбат натрия восстанавливает нитроксильные группы до диамагнитных продуктов, предположительно до гидроксиламинов. Скорость восстановления нитроксилов зависит от наличия того или иного магнитного окружения. Этот метод был использован при изучении диффузии фосфолипидов из внутреннего монослоя бислойных молекул во внешний монослой (Kornberg R.D., McConnel H.M., 1971). Подобным образом по скорости восстановления нитроксилов можно исследовать скорость проникновения иона аскорбата в ориентированные бислои фосфолипидов, содержащие спиновые зонды, и оценивать относительную глубину погружения в бислой нитроксильных фраг
ментов спиновых зондов. Для данного спинового зонда относительные значения скорости восстановления служат индикаторами проницаемости бислоя в разных условиях (Butler K.W., Pharm J., 1976; Schreier-Mucello S., Marsh D.,. Smith J.C.P, 1976).
Не только аскорбат (Kornberg R.D., McConnell H.M., 1971) и глютатион (Morrisett J.D., Droll H.R., 1969) способны восстанавливать нитроксильные радикалы, что приводит к потере парамагнетизма. Этим свойством обладают и некоторые ферменты. Так, кинетика восстановления спин-меченного фосфата и 5-доксилстеариновой кислоты микросомальными мембранами, содержащими гидроксилирующую ферментную систему из цитохрома P450 и цитохром Р450-редуктазы, была изучена Стиром и Сакманом (Stier, Sackman E., 1973). Исследования, проводимые с помощью спиновых меток со времен первых работ Мак-Коннелла и сотр. (Ziebling D.R., McConnell

8. M., 1965; Wood D.E., McConnell H.M., 1962), благодаря их высокой эффективности и методической простоте стали одним из основных инструментов исследования биополимеров и мембран. Основные усилия метода спиновых меток направлены в основном на решение фундаментальных вопросов ферментативного катализа и физической химии белков. Метод позволяет исследовать топографию белковой поверхности, информационные переходы, локальную подвижность и микровязкость белковой матрицы, строение и динамику активных центров.

Спин при любом квантовом числе n всегда определяется выражением (h/2p)A/n(n+T) . При этом полный угловой момент колеблется вокруг некоторой фиксированной оси так, что его усредненная по времени составляющая вдоль этой
оси равна (h/2p) • n, а перпендикулярная к оси составляющая в результате усреднения обращается в нуль. В каждый момент времени состояние неспаренного электрона определяется проекцией MS его спина на эту ось и характеризуется величиной MS= +1/2 или -1/2 для одного неспаренного электрона в зависимости от ориентации полного углового момента. Для характеристики нескольких неспаренных электронов нужна общая координатная ось, которая может быть при наличии внешнего магнитного или электрического поля. Спины неспаренных электронов, обладающих одинаковой энер
гией, ориентированы случайным образом. При наличии внешнего магнитного поля возникает общая координатная ось, вокруг которой все электроны начнут колебаться так, что проекция их спина на эту ось - MS будет равна либо +1/2, либо -1/2. Это единственные возможные состояния, подчиняющиеся закону квантования, который разрешает только квантовые состояния с разницей их чисел на одну единицу.
При наложении внешнего магнитного поля неспаренные электроны разделятся на две группы. В одной - спины электронов будут ориентированы параллельно направлению поля, а в другой - антипараллельно. Энергия их будет разной, так как при ориентации магнитного момента параллельно магнитному полю энергия электрона уменьшится, а при ориентации его в обратном направлении - возрастает. Таким образом, электроны разбиваются на две группы, обладающие разными энергиями - происходит расщепление энергетических уровней. На этом принципе и основан метод электронного парамагнитного резонанса.
Спиновые зонды являются активными акцепторами электронов. Для завершения реакции восстановления необходимы протоны. В среде, содержащей протоны, роль восстановителя могут играть любые соединения с достаточно высоким восстановительным потенциалом: муравьиная кислота, гидразин, гидрохинон, соединения с сульфгидрильными группами и др. Спиновые зонды восстанавливаются до пространственно затрудненных N-гидроксиламинов, не дающих вклад в спектр ЭПР. Скорость восстановления спинового зонда тем меньше, чем длинней его углеводородный “хвост”, что, по-видимому, связано с меньшей подвижностью радикалов с длинной углеводородной цепью.
Вращательная трансляционная подвижность спиновых зондов, измеренная с помощью техники электронного парамагнитного резонанса, дает информацию о структуре, конформа- ционной динамике, микрорельефе и топологии исследуемых объектов. По мнению Борра и Кошланда (Burr M., Koshland D.J., 1964), такая репортерная группа должна обладать следующими свойствами:

1. Она должна, будучи введенной в определенные участки изучаемой системы, сообщить по изменению собственной структуры о характере ее окружении.
   
2. Ее регистрируемые свойства должны быть уникальными или резко отличаться от свойств исследуемой системы.
3. Репортерная группа не должна оказывать влияние на изучаемую систему, но сообщать о всех ее изменениях.

В настоящее время получают распространение разнообразные нитроксильные радикалы с насыщенными углеводородными цепями любой длины. При наличии у реагирующей молекулы двух и более реакционных групп реакции без затрагивания свободной валентности приводят к соединениям радикалов между собой и с образованием бирадикалов и полирадикалов.
Практическая возможность проведения реакции без затрагивания свободной валентности определяется скоростью прохождения в реакционной смеси параллельных реакций. Из конкурентных реакций основными являются реакции с насыщенной свободной валентностью. Так, например, хлористый водород, образующийся при взаимодействии спирт-радикала с хлорангидридом дикарбоновых жирных кислот способен вызывать реакцию диспропорционирования между радикалами, приводящую к образованию не парамагнитных продуктов (Розанцев Э.Г., 1970).