Новые физические и химические методы исследования, применяемые биологами и медиками, как правило, являлись факторами ускоренного развития этих областей естествознания. Многие из этих методов стали непременными средствами обследования больных в поликлиниках и клинических стационарах, служат практически целям медицины в течение многих десятилетий. Этого, к сожалению, нельзя сказать о методе ЭПР, который может быть использован для изучения жидких сред организма, продуктов выделения органов, обладающих экскреторной функцией (слюны, желчи, соков поджелудочной железы и желудка, мокроты, мочи и т.п.), волос, ног
тей, кусочков тканей, взятых при биопсии кожи, слизистых оболочек, печени, лекарственных веществ различного происхождения и действия, физиологически активных веществ (антибиотиков, витаминов, гормонов, медиаторов нервного возбуждения), вакцин, сывороток, кровезаменителей, болезнетворных микробов, микробов-сапрофитов, а также для изучения тканей и органов животных в биохимическом, физиологическом и патофизиологическом экспериментах.
Отечественными и зарубежными исследователями установлена связь между состоянием парамагнитных центров и интенсивностью, а также характером процессов, протекающих в биологических тканях. В частности, отмечено изменение концентрации парамагнитных центров и исследуемых параметров ЭПР-спектров при изменении нормального физиологического состояния организма. Так, были получены данные, свидетельствующие об этом факте, при исследовании злокачественных новообразований (Саприн А.И. и соавт., 1968), лучевой болезни (Эммануэль Н.М., 1966). Отдельные работы были посвящены изучению состояния донорно-акцепторных процессов (Кравцов Ю.К. и соавт., 1972, 1977; Кочергинский
Н.М. и соавт., 1974).
Важную главу в исследованиях, проведенных с помощью ЭПР явилось изучение свободных радикалов и канцерогенеза. Так, M.J.Zyons, J.F.Gibson, D.J.E.Ingzam (1958), провели ряд предварительных экспериментов по установлению связи между содержанием неспаренных электронов и канцерогенной активностью. Изучали спектры ЭПР конденсата табачного дыма и показали наличие в нем активных агентов, которые при соприкосновении с тканью легких могут вступать в реакции химического взаимодействия.
При исследовании некоторых веществ, обладающих канцерогенной активностью, были обнаружены высокие концентрации неспаренных электронов (Szent-Gyorgi A., Isenberg I., Baird S.Z., 1960). Была установлена определенная зависимость между концентрацией свободных радикалов и ростом, распадом, метастазированием злокачественных опухолей, а также изменениями в различных тканях, имеющими злокачественный характер. В связи с этим появилась возможность, используя метод ЭПР, провести дифференцировку гомологичных опухолей, находящихся на разных стадиях развития.
Процесс малигнизации ткани и рост опухоли сопровождается значительными количественными изменениями свободно-радикальных центров и парамагнитных металлокомп- лексов, участвующих и биологическом окислении как в свободном, так и связанном с процессами фосфорилирования, а также в процессах накопления и расхода аденозинтрифос- форной кислоты. При этом может быть как избыточное образование парамагнитных комплексов, так и усиление их распада; переход в другие неактивные или высокоактивные парамагнитные комплексы (Богданов Г.Н. и соавт., 1976; Эммануэль Н.М., 1977; Сидорин В.Н., Береговская Н.Н., 1981).
Одной из причин малой доступности метода ЭПР в области экспериментальной и клинической медицины является слабая популяризация его возможностей. Вместе с тем метод ЭПР может оказаться весьма полезным спутником врача в его деятельности, начиная с диагностики заболеваний и кончая их лечением и профилактикой. Об этом с уверенностью можно говорить потому, что этот метод в последние годы уже показал свою полезность в медико-биологических исследованиях, хотя эти исследования проводились в основном специалистами немедицинского профиля.
Вначале были предприняты попытки изучения с помощью метода ЭПР парамагнитных свойств тканей и органов животных при некоторых физиологических и патологических процессах и состояниях (рефлекторных и денервационных дистрофиях тканевых образований, различных видах наркоза, эпилепсии, асфиксии, гипоксии, нитритной метгемоглобинемии, гипотермии, воспалении, различных стадиях онтогенеза, старении, гипертиреозе, кастрации, повышенном содержании в организме ряда гормонов и т.п.). Выводы по этим работам сводились к тому, что дистрофические изменения органов и тканей нейрогенного происхождения, учитываемые по морфологическим и биохимическим показателям, сопровождаются выраженными сдвигами в содержании в тканевых структурах свободных радикалов. Было высказано предположение, что сдвиги в содержании свободных радикалов при нейрогенных дистрофиях являются следствием нарушения окислительно-восстановительного метаболизма в исследуемых объектах, т.е. следствием нарушения в стандартном звене обмена веществ. Подробно была изучена кинетика содержа
ния свободных радикалов в тканях животных в процессе по- стнатального онтогенеза, включая период старения. Затем, и особенно в последние годы, в литературе стали появляться результаты изучения ряда других медико-биологических и медицинских проблем при помощи метода ЭПР.
Установлено, что метод ЭПР может быть успешно использован при решении вопросов, относящихся к механизмам регуляции структуры и функций желез внутренней секреции в норме и при экспериментальных условиях существования организма, механизмам воздействия гормонов с клеткой, характеру реакции неэндокринных клеток на гормональные воздействия, биосинтезу и дальнейшему метаболизму гормонов.
Полученные результаты исследований тканей животных и человека могут привлечь внимание витаминологов и специалистов в области физиологии труда и спорта, геронтологии и инфекционной патологии. Токсикологам могут быть небезынтересны данные о том, что введение животным аскорбиновой кислоты при нитрит- ной метгемоглобинемии приводило к резкому снижению интенсивности характерного для этого состояния сигнала ЭПР крови, что связывается с распадом под влиянием аскорбиновой кислоты нитрозильного комплекса гемового железа.
Микробные клетки, благодаря своим особенностям и многообразию, позволили решить с помощью метода ЭПР многие общие вопросы, относящиеся к парамагнитным свойствам биологических объектов (например, вирулентность микроорганизмов), что в определенной мере обусловливается особенностями свободно радикального состояния веществ, экстрагируемых из их липидных фракций, а интенсивность сигнала ЭПР и его форма могут быть использованы для определения степени патогенности штаммов микробов в эпидемиологических целях. Возможно, что антиоксиданты, оказывающие влияние на интенсивность обмена свободных радикалов, найдут применение как средство ослабления или усиления вирулентности микроорганизмов.
Механизм действия чумного токсина сводится к блокированию ферментов, ответственных за восстановление кофер- мента Q в митохондриях. Проведено исследование дифтерийного токсина и анатоксина методом ЭПР, благодаря чему открылись возможности использования данного метода при анализе механизмов развития токсико-инфекционных забо
леваний. Метод ЭПР может найти применение при изучении проблемы сохранения и восстановления активности лиофили- зированных микробных клеток, позволит улучшить контроль за сохранением таких лиофилизированных препаратов, как вакцины, сыворотки, кровь, кровезаменители, пищевые продукты.
В области иммунологии в ряде исследований предпринята попытка изучить при помощи метода ЭПР активные центры, структурные изменения антител и антигенов при образовании специфического комплекса. Отмечено, что образование иммунных комплексов антител и антигенов приводит к изменению времени корреляции спиновых меток ковалентно связанных с антителом или антигеном, что комплексооб- разование антител с антигенами сопровождается конформа- ционными изменениями обоих белков и в условиях образования преципитата, и в его отсутствии.
Установлено, что поведение и конформация антител зависят от величины электростатических сил отталкивания и других факторов, что образование иммунных комплексов антител и антигенов во всех случаях сопровождается однотипными конформационными изменениями антител.
Нормальные антитела групп крови системы АВ0 вызывают в мембранах эритроцитах человека структурную перестройку, сопряженную с кооперативным связыванием антител с рецепторами, обнаружено, что наиболее значительные изменения происходят в мембранных белках, прежде всего, в спект- риновой сети. Действие антител сопровождается функциональными сдвигами в эритроцитах - активируется процесс агглютинации и модифицируется каталитическая активность мембранно-связанного фермента - ацетиламинэстеразы.
Накоплен большой опыт применения изолированно облученной ультрафиолетовым светом аутокрови в клинической и ветеринарной практике, но до сих пор не установлен механизм ее биологического действия. Используя для ультрафиолетового облучения кровь донора, стабилизированную гепарином или нитратом натрия, нашли, что при малых дозах облучения, которые используются в клинической практике, форменные элементы крови не подвергаются заметной фотодеструкции, существенно не изменяется и гемоглобин. Вместе с тем авторами установлено, что при действии прямых или сенсибилизированных фотопроцессов основные фотохимичес
кие изменения развиваются в сыворотке крови. При этом происходит разрушение пептидных связей белков сыворотки крови. Промежуточные свободно-радикальные продукты этих фотореакций стабильны и легко обнаруживаются с помощью метода ЭПР.
В механизмах формирования реакции организма человека и животных на действие токсических веществ экзогенного и эндогенного происхождения принимают участие все уровни организации живой истории, в том числе и электронной. Поэтому метод ЭПР сравнительно быстро нашел применение в токсикологических исследованиях.
В первых работах такого рода показано, что не только последствия острой интоксикации фенолом у животных в эксперименте, но и в результате влияния нетоксических доз этого вещества в производственных условиях у практически здоровых людей могут быть обнаружены методом ЭПР при тестировании сигналов ЭПР эритроцитов. Поскольку существенные сдвиги концентрации свободных радикалов в компонентах крови при отравлении парами фенола проявляются раньше клинических признаков интоксикации, этот показатель может быть использован для санитарно-гигиенического контроля.
С помощью метода ЭПР предпринята попытка решить вопрос о сенсибилизации и адаптации живых организмов при вдыхании паров этилового спирта. Проведено исследование влияния этанола (96%) на образование свободных радикалов аскорбиновой кислоты, галловой кислоты, пирокатехина, гидрохинона и хинона в высушенных образцах крови после контакта с кислородом влажного воздуха. Добавление этанола к консервированной крови человека вызывало снижение сигнала ЭПР аскорбиновой кислоты в сравнении с исходным уровнем, не изменяло сигнала ЭПР галловой кислоты и усиливало сигнал пирокатехина, гидрохинона и хинона. Изменение сигнала ЭПР под воздействием этанола, по мнению авторов, зависит от соотношения концентраций аскорбиновой кислоты и фенольных соединений в исследуемой крови. Отмечено, что при хроническом алкоголизме наблюдается изменение текучести мембран, приводящее к снижению связывания этанола, анестетиков и различных гидрофобных молекул.
Бензол, имеющий большое промышленное значение и содержащийся в ощутимых количествах в атмосфере, отно
сится к числу наиболее токсических соединений среди ароматических углеводородов. Изучено влияние бензола на парамагнитные свойства печени и головного мозга животных. Исследовано также влияние на содержание свободных радикалов в указанных органах крыс дихлордифенилтрихлорэта- на. Проведены исследования в отношении н-бутанола, борной кислоты, четыреххлористого углерода.
Начиная с середины 60-х годов стали появляться публикации, содержащие результаты исследований при помощи метода ЭПР парамагнитных центров тканей животных, образующихся после введения последним различными способами нитритов и нитратов или же при инкубации тканей с этими веществами и окисью азота. Интерес к этим веществам объясняется тем, что нитриты с давнего времени известны как метгемоглобинообразователи и могут поступать в организм человека и животных с пищей, водой и вдыхаемым воздухом.
Нитраты сами по себе не являются метгемоглобинобра- зователями, но, попадая в желудочно-кишечный тракт, они под влиянием нитратредуцирующей микрофлоры быстро переходят в нитриты, которые, всосавшись в кровь, приводят к образованию метгемоглобина, количество которого может быстро возрастать при несовершенстве ферментативной системы, восстанавливающей метгемоглобин в гемоглобин. Предполагается и другой механизм поступления нитритов в кровь при попадании больших количеств нитратов с пищей. Нитраты в кишечнике всегда восстанавливаются в нитриты, а нитриты - в аммиак, который затем удаляется из организма. При большом поступлении нитратов нитриты не успевают полностью превратиться в аммиак, всасываются в кровь и приводят к метгемоглобинобразованию. Методом ЭПР было доказано, что гипоксия тканей при нитритной метгемоглобинемии связана не только с нарушением транспортной функции гемоглобина, как предполагали в прежние годы, но и с блокадой в клетках железосодержащих веществ, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях.
Благодаря методу ЭПР уточнен механизм токсического действия и цианистых соединений. Оказалось, что наступающую при отравлении цианистым калием гипоксию тканей нужно именовать не только чисто токсической, но и в определенной мере циркуляторной или точнее, гипоксемической, так как наря
ду с подавлением тканевого дыхания цианиды нарушают транспортную функцию эритроцитов по отношению к кислороду.
К настоящему времени накопилось значительное число работ, посвященных изучению методом ЭПР ряда патологических процессов и состояний, механизмов заболевания и выздоровления.
Метод ЭПР был использован для решения такого важного вопроса радиологии, как природа разной радиочувствительности клеток живого организма, которую сводят к различным механизмам, в том числе и к различной чувствительности к радиации наследственного аппарата тех или иных клеток, к различиям их репарационных возможностей, а также к различному содержанию в клетках веществ, способных изменять реакцию клеток на облучение, например, тиолов, биогенных аминов и др. Развитие техники ЭПР привело у новому этапу применения метода в радиологии. Данный метод с успехом может быть использован для решения таких вопросов радиологии, как природа радиочувствительных биологических объектов, как взыскание наиболее эффективных средств защиты клеток от действия облучения или направленного радиационного поражения опухолевых клеток и как поиск эффективных радиопротекторов и радиосенсибилизаторов. Сравнительное изучение методом ЭПР реакций нормальной и опухолевой клеток на облучение может дать информацию о специфике биохимического состояния трансформированных клеток. Появилась возможность применять метод в дозиметрии
и,              особенно важно, для изучения первичных механизмов действия для медицины доз радиации на клетки, субклеточные структуры и важные макромолекулы.
Нервно-дистрофический процесс является стандартной реакцией организма на чрезвычайные воздействия, в которую включаются практически все ткани, органы и системы. Однако ведущим звеном этой реакции служат первичные дистрофические изменения в ЦНС, которые регламентируют и интенсивность физико-химических, морфологических и функциональных сдвигов в остальных тканях, органах и системах, развивающихся в результате патологических рефлекторных и прямых гуморальных влияний на тканевые образования. Считается общепризнанным, что непременными и ведущим звеном механизма развития любого патологического процесса
является его нервно-дистрофический компонент, который определяет трофическое состояние ткани и органа, следовательно, интенсивность их специфической метаболической и функциональной реакции на раздражители внутренней и внешней среды. В условиях нарушения трофики тканей и органов (нейрогенных дистрофий) интенсивность этих реакций может выходить за пределы нормальных колебаний. Эти отклонения от нормы и составляет сущность специфических патологических изменений периферических тканевых образований.
Методом ЭПР установлено, что дистрофические изменения в самой нервной системе и нейрогенные дистрофии периферических тканей и органов протекают при непременных местных сдвигах в обмене свободных радикалов. Можно считать, что свободные радикалы - это не свидетели и не побочные участники, а обязательное стандартное звено механизма нервно-трофических нарушений. Это следует из того, что в любое изменение трофики ткани под влиянием нервного стимула сопровождается сдвигами стандартной биохимической цепи клетки, обеспечивающей процессы биологического окисления и окислительного фосфорилирования. Приносимые к клетке или образующиеся при ее первичном контакте с медиаторами свободные радикалы, а также парамагнитные комплексы включаются в качестве непременного компонента в инициальное звено механизма развития нейрогенных дистрофий. Последующие, “вторичные” сдвиги концентрации парамагнитных центров в клетке также играют патогенетическую роль.
Метод ЭПР оказался полезным при изучении врожденных заболеваний мышечной системы человека. С помощью спиновых меток установлено, что мембраны эритроцитов периферической крови больных наследственной мышечной дистрофией обладают меньшей вязкостью и, следовательно, большей проницаемостью, чем мембраны эритроцитов здоровых людей. При помощи спиновой метки, ковалентно связывающейся с белками, показано, что существуют различия между конформацией и организацией мембранных белков эритроцитов в норме и при мышечной дистрофии разного происхождения (болезнь Дюшена, миотоническая мышечная дистрофия). Результаты этих работ можно использовать для поисков эффективного способа раннего распознавания наследственных заболеваний мышечной системы.
Метод ЭПР широко применяется для изучения структурной организации мембран эритроцитов в гематологии, изучены поверхностные, промежуточные и глубинные слои мембран эритроцитов, а также изолированные мембраны тканей эритроцитов. Метод спиновой метки является не только средством для исследования мембран, он может быть использован при диагностике некоторых заболеваний крови (хронический гемолиз и др.). Отмечены возможности применения метода для характеристики серологических особенностей эритроцитов, при исследовании подгрупп лимфоцитов и для тестирования функции тромбоцитов. Существуют данные об использовании метода ЭПР при изучении процесса старения отдельных клеток крови.
При помощи метода электронного парамагнитного резонанса изучены механизмы действия антибиотиков и зависимости их биологической активности от химического строения, действия их на различные этапы транспорта электронов при осуществлении реакций свободного дыхания, окислительного фосфорилирования и анаэробного дыхания.
Метод может быть широко и эффективно использован при решении ряда вопросов высокогорной и подводной физиологии, авиационной и космической медицины, а также практических вопросов, относящихся к патологии внешнего дыхания в северных регионах страны.
Обнаружение неспаренных электронов в коже человека и животных, доступность этой ткани для различного рода исследований при помощи практически безопасного в данном случае метода биопсии, а также способности кожи чутко реагировать на различные изменения во внешней и внутренней средах организма сдвигами в содержании свободных радикалов позволяют считать, что метод ЭПР найдет в будущем широкое применение в экспериментальной и клинической дерматологии. В настоящее время метод дает хорошие результаты в диагностике псориаза, его лечение и профилактике, а также используется для выяснения молекулярных механизмов терапевтического действия псораленов (фуранокума- рина), которые применяют в клинике кожных болезней при лечении витилиго и гнездной плешивости.
Предпринимаются попытки изучить при помощи метода ЭПР свойства сердечной мышцы, испытывающей недостаточное снабжение кровью или полное прекращение поступления ее к тому или иному участку миокарда.
Метод ЭПР был применен для исследования ишемической болезни сердца (Керимов Т. и соавт., 1977), атеросклероза (Артемова Л.Г. и соавт., 1977). В этих работах были изучены структурные характеристики и белково-липидные взаимодействия в комплексах липопротеидов.
Одним из основных условий существования живого организма является бесперебойное функционирование системы циркуляции жидкости. Пути микроциркуляции обеспечивают постоянный и достаточный приток к тканям питательных веществ и кислорода. Микроциркуляция и состояние ее путей влияют на все физиологические отправления, и, следовательно, на ход многих патологических процессов (Куприянов В.В., 1969). Отечественными и зарубежными исследователями отмечено, что система микроциркуляции первой вовлекается в патологический процесс при различных воздействиях. В ней происходят наиболее значительные перестройки при экстремальных состояниях, когда мобилизуются все адаптивные механизмы для поддержания и сохранения гемостаза и жизни организма (Куприянов В.В., 1976; Чернух А.М., 1980; Zweifach B.W., 1961). Комплексный подход к изучению микроциркуляции позволил оценить последствия исследования ее нарушения при многих патологических процессах (Александров П.Н., 1984).
Ожоговая болезнь, давно привлекавшая внимание клиницистов и экспериментаторов в связи со сложностью механизмов ее развития, возникающими осложнениями в организме и трудности лечения, также явилась предметом исследования при помощи метода ЭПР. При ожоговой болезни развиваются глубокие нарушения обменных процессов, патологические нарушения во всех тканях, органах и системах организма, что находит отражение в изменениях различных параметров крови и других жидких сред организма, а также экскретов потовых, сальных, пищеварительных желез и почек.
Исследованию изменений в состоянии кожи и ткани печени после ожогов посвящена работа З.В.Куроптева и соавт. (1981). Авторами обнаружено, что спектры ЭПР печени крыс на 2, 7 и 18-е сутки после ожога обусловлены теми же центрами, что и спектр ЭПР печени в норме. Характерным является снижение интенсивности сигнала ЭПР на одни сутки с последующим увеличением их до нормы.