ЭКВОРИН — ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ИЗ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ
Наряду с открытием в морских организмах БАВ, в той или иной степени способных оказывать ингибирующее влияние на клеточное деление и рост злокачественных новообразований, в биопродуктах гидробионтов обнаружены соединения, характеризующиеся исключительно высокой чувствительностью к изменениям фундаментальных параметров клеточной мембраны, сигнализируя о начале злокачественных изменений клетки. Среди таких веществ диагностического плана совершенно особое значение имеет экворин, позволяющий регистрировать незначительные нарушения клеточных функций, связанных с изменением концентрации кальция в организме человека, которые могут сообщить о реакциях онкогенного перерождения клеток или поражения сердечной мышцы. Иначе говоря, экворин позволяет определять следовые количества катионов кальция и стронция в биологических объектах, а также изменения их концентрации в биологических жидкостях. Экворин выделяют из медуз вида Aequorea aequorea, встречающихся в весьма большом количестве в водах северно-западной части Тихого океана, особенно у побережья Северной Америки. Aequorea aequorea нередко забивают сети, предназначенные для ловли лососевых рыб. Средний размер Aequorea aequorea — 7—8 см, но встречаются экземпляры, достигающие 18 см в диаметре. При химическом или ином раздражении Aequorea aequorea начинает лю- минесцировать ярким голубовато-зеленым светом. Ткани медузы содержат почти 98% воды и веществ, обусловливающих отвратительный запах, что издавна служит причиной отказа от употребления медуз в пищу. Этот вид медуз в течение длительного времени рассматривался как совершенно неперспективный в медико-биологическом, народнохозяйственном аспектах. Однако обнаружение биолюминесцирующего фактора в экстрацеллю- лярном пространстве Aequorea aequorea и переход его в экстрагирующую жидкость, а также последующая идентификация в
качестве возможного индикатора следовых количеств ионов кальция в корне изменили отношение исследователей к этому виду медузы. Последующие интенсивные поиски новых источников биолюминесцирующих БАВ привели к открытию еще ряда продуцентов этих интересных веществ, характеризующихся, однако, меньшей специфичностью и сложностью выделения. Принципиальное отличие биолюминесцирующего фактора, выделенного из Aequorea aequorea,— его способность светиться в отсутствии растворенного в воде кислорода при условии наличия ионов кальция. Как известно, в классических наблюдениях биолюминесценция является следствием взаимодействия нескольких веществ. Примером может служить биолюминесценция в системе люциферин—люцифераза (фермент)-—растворенный кислород.
Методика выделения экворина заключается в измельчении медуз и последующем экстрагировании гомогенизированных тканей животных. При этом сосредоточенный в виде гранул размером до 0,5 мк экворин переходит в экстрагент. В процессе фильтрации экворин сорбируется фильтрующими материалами, из которых легко десорбируется. Окончательная очистка экворина осуществляется гель-фильтрацией на колонках с се- фадексом (G 25, G 50, G 100, G150). Лиофилизированный порошок высокоочищенного экворина сохраняется при низких температурах. Экворин является индивидуальным белком с м.в. около 35 000. Он дает соответствующие положительные для белков реакции, в том числе биуретовую и нингидринную; осаждается сульфатом аммония, деградирует при повышении температуры, теряя способность люминесцировать, легко инактивируется при понижении pH; сохраняет способность биолю- минесцировать в водных растворах. Растворы экворина в воде прозрачны, при добавлении же сульфата аммония быстро желтеют.
Получение и очистка экворина — трудоемкие операции, требующие наряду с соблюдением особо щадящих условий довольно сложное оборудование. Это, несомненно, ведет к вздорожанию продукта, содержание которого в тканях медузы характеризуется незначительной концентрацией: из 10000 медуз удается получить около 5 мг высоко очищенного экворина. Несмотря на то, что экворин люминесцирует в присутствии следов кальция, проявляя особую избирательность, обнаружен ряд соединений, способных уменьшать или, наоборот, повышать его биолюминесцирующую активность.
Молекула экворина содержит единственную хромофорную группу, ответственную за биолюминесценцию. Оказалось, что м. в. флюоресцирующей части молекулы экворина равен 277. Хромофорная часть молекулы экворина была изолирована, было установлено ее строение, подтвержденное синтезом. Ответственная за флюоресценцию часть молекулы экворина являет-
ся 2-амино-З бензил-5-(Д-гидроксифенил)-пиразином (Kishi
et al., 1972).
Тем не менее механизм биолюминесценции экворина остается невыясненным, особенно громадная эмиссия энергии при- его флюоресценции. По мнению Johnson (1970), область применения экворина может быть весьма обширной, начиная от технических областей и кончая биологией. Наиболее перспективно использование экворина для исследования молока (определение ионов кальция, стронция), а также в сельскохозяйственных, биологических, медицинских лабораториях. Особенно интересно и перспективно его применение при изучении фундаментальных свойств клеток и клеточных структур, в частности при исследовании влияния ионов на активность митохондрий. Экворин позволяет определить наличие весьма слабых концентраций солей кальция в биологических объектах и обходиться исключительно незначительным количеством биологического материала. При использовании экворина в аналитических целях обычно строят калибровочные кривые, исходя из содержания 15 мкг экворина в 1 мл. Для регистрации изменений содержания кальция и его концентрации в биологические объектах требуется не более 2 мкл образца. Определению содержания кальция в случае использования «экворинового метода» совершенно не мешают ионы натрия, калия, магния, фосфаты, белки и т. д.
Более широкое применение экворина ограничено сложностью методов получения и очистки и отсутствием соответствующих аналитических методик для использования его в качестве индикатора. Интригующие свойства экворина, однако, позволяют надеяться, что и в нашей стране этому БАБ гидробионтов будет уделено определенное внимание и будут изысканы, возможно, его другие источники и аналоги.
качестве возможного индикатора следовых количеств ионов кальция в корне изменили отношение исследователей к этому виду медузы. Последующие интенсивные поиски новых источников биолюминесцирующих БАВ привели к открытию еще ряда продуцентов этих интересных веществ, характеризующихся, однако, меньшей специфичностью и сложностью выделения. Принципиальное отличие биолюминесцирующего фактора, выделенного из Aequorea aequorea,— его способность светиться в отсутствии растворенного в воде кислорода при условии наличия ионов кальция. Как известно, в классических наблюдениях биолюминесценция является следствием взаимодействия нескольких веществ. Примером может служить биолюминесценция в системе люциферин—люцифераза (фермент)-—растворенный кислород.
Методика выделения экворина заключается в измельчении медуз и последующем экстрагировании гомогенизированных тканей животных. При этом сосредоточенный в виде гранул размером до 0,5 мк экворин переходит в экстрагент. В процессе фильтрации экворин сорбируется фильтрующими материалами, из которых легко десорбируется. Окончательная очистка экворина осуществляется гель-фильтрацией на колонках с се- фадексом (G 25, G 50, G 100, G150). Лиофилизированный порошок высокоочищенного экворина сохраняется при низких температурах. Экворин является индивидуальным белком с м.в. около 35 000. Он дает соответствующие положительные для белков реакции, в том числе биуретовую и нингидринную; осаждается сульфатом аммония, деградирует при повышении температуры, теряя способность люминесцировать, легко инактивируется при понижении pH; сохраняет способность биолю- минесцировать в водных растворах. Растворы экворина в воде прозрачны, при добавлении же сульфата аммония быстро желтеют.
Получение и очистка экворина — трудоемкие операции, требующие наряду с соблюдением особо щадящих условий довольно сложное оборудование. Это, несомненно, ведет к вздорожанию продукта, содержание которого в тканях медузы характеризуется незначительной концентрацией: из 10000 медуз удается получить около 5 мг высоко очищенного экворина. Несмотря на то, что экворин люминесцирует в присутствии следов кальция, проявляя особую избирательность, обнаружен ряд соединений, способных уменьшать или, наоборот, повышать его биолюминесцирующую активность.
Молекула экворина содержит единственную хромофорную группу, ответственную за биолюминесценцию. Оказалось, что м. в. флюоресцирующей части молекулы экворина равен 277. Хромофорная часть молекулы экворина была изолирована, было установлено ее строение, подтвержденное синтезом. Ответственная за флюоресценцию часть молекулы экворина являет-
ся 2-амино-З бензил-5-(Д-гидроксифенил)-пиразином (Kishi
et al., 1972).
Тем не менее механизм биолюминесценции экворина остается невыясненным, особенно громадная эмиссия энергии при- его флюоресценции. По мнению Johnson (1970), область применения экворина может быть весьма обширной, начиная от технических областей и кончая биологией. Наиболее перспективно использование экворина для исследования молока (определение ионов кальция, стронция), а также в сельскохозяйственных, биологических, медицинских лабораториях. Особенно интересно и перспективно его применение при изучении фундаментальных свойств клеток и клеточных структур, в частности при исследовании влияния ионов на активность митохондрий. Экворин позволяет определить наличие весьма слабых концентраций солей кальция в биологических объектах и обходиться исключительно незначительным количеством биологического материала. При использовании экворина в аналитических целях обычно строят калибровочные кривые, исходя из содержания 15 мкг экворина в 1 мл. Для регистрации изменений содержания кальция и его концентрации в биологические объектах требуется не более 2 мкл образца. Определению содержания кальция в случае использования «экворинового метода» совершенно не мешают ионы натрия, калия, магния, фосфаты, белки и т. д.
Более широкое применение экворина ограничено сложностью методов получения и очистки и отсутствием соответствующих аналитических методик для использования его в качестве индикатора. Интригующие свойства экворина, однако, позволяют надеяться, что и в нашей стране этому БАБ гидробионтов будет уделено определенное внимание и будут изысканы, возможно, его другие источники и аналоги.