(???).Контрольные вопросы
1. Понятие «стерильные лекарственные формы».
2. Современные лекарственные средства, к которым предъявляются требования стерильности (дополнения к ГФ XI).
3. Удельный вес стерильных растворов в рецептуре больничных аптек.
4. Обеспечение стерильности: а) соблюдение правил асептики, б) выбор правильного метода и режима стерилизации.
5. Растворы, стерилизуемые в конечной упаковке.
6. Растворы, не подлежащие стерилизации, а изготавливаемые в асептических условиях.
7. Консерванты и требования к ним.
8. Источники формирования пирогенности инъекционных и инфузионных растворов.
9. Методы современного контроля пирогенности инъекционных и инфузионных растворов:
а) биологический метод (ГФ XI),
б) применение ЛАЛ-теста для определения эндотоксина (ВФС 42-2960-97),
в) микробиологический метод (дополнения к методическим рекомендациям по микробиологическому контролю в аптеках от 1990 г.).
10. Санитарно-микробиологические требования к микробной обсемененности субстанций, используемых для приготовления инъекционных растворов.
11. Правила исследования на стерильность лекарственных препаратов.
(!!!) Задания для практической работы
1. Работа с ситуационными задачами по анализу ОМЧ воды для инъекций до стерилизации.
2. Работа с ситуационными задачами по анализу ОМЧ субстанций до стерилизации.
3. Работа с ситуационными задачами по анализу результатов контроля стерильности инъекционных и инфузионных растворов.
Лекарственные средства, к которым предъявляется требование стерильности:
ü инъекционные и инфузионные растворы и другие виды препаратов для парентерального введения (вводимые в полость суставов, в плевральную полость и т. д.);
ü глазные капли после стерилизации и изготовленные в асептичесих условиях;
ü все глазные препараты (мази, пленки, офтальмологические растворы для орошения и др.);
ü препараты, наносимые на открытые раны и ожоги;
ü жидкие лекарственные средства для новорожденных;
ü медицинские иммунобиологические препараты (МИБП).
В аптеках лечебных учреждений до 30-40% рецептуры составляют инъекционные лекарственные формы. Некоторые инъекционные растворы не выдерживают термической стерилизации (барбамил, мединал, адреналина гидрохлорид и др.). Некоторые из препаратов в инъекционных растворах сами по себе оказывают бактерицидное действие (аминазин, дипразин, гексаметилентетрамин и др.
Инъекционные растворы должны быть стерильными, так как они вводятся через полую иглу с нарушением целости кожных и слизистых покровов.
По требованию врача могут быть стерильными мази, присыпки, пластыри. Требования стерильности этой категории лекарственных форм не лишены оснований: зарегистрированы случаи заражения столбняком при использовании нестерильных присыпок.
При заводской технологии изготовления инъекционных растворов воздух в ампульные цехи подается профильтрованный, стерильный.
Инъекционный способ введения лекарственных форм имеет ряд преимуществ:
ü быстрота действия вводимых лекарственных препаратов;
ü отсутствие разрушительного действия ферментов желудочно-кишечного тракта и печени на лекарственные формы;
ü отсутствие действия медикаментов на органы вкуса и обоняния и раздражения желудочно-кишечного тракта;
ü полное всасывание вводимых лекарственных форм;
ü возможность точной локализации действия лекарств (в случае применения анестезирующих веществ);
ü точность дозирования;
ü возможность введения лекарства больным, находящимся в бессознательном состоянии;
ü возможность заготовки инъекционных препаратов впрок (в ампулах).
Требования, предъявляемые к инъекционным растворам (ГФ XI):
ü стерильность;
ü апирогенность;
ü стабильность;
ü отсутствие механических включений.
Состав практически всех растворов для инъекций, а также способы обеспечения их стерильности и стабильности регламентированы.
Требование стерильности предполагает отсутствие в препарате микроорганизмов на любой стадии их развития. Это ведущее требование должно обеспечиваться следующими приемами:
ü соблюдение правил асептики при изготовлении раствора,
ü выбор правильного метода и режима стерилизации.
Стерильные растворы аптечного изготовления делятся на две группы:
ü растворы, которые стерилизуются в конечной упаковке;
ü растворы, которые не подлежат стерилизации и готовятся в асептических условиях на основе стерильной воды с использованием стерильных растворителей, посуды, вспомогательных материалов, с применением мембранной фильтрации и т. д.
Необходимым компонентом любого стерильного лекарственного препарата являются растворители:
ü вода очищенная;
ü вода для инъекций;
ü жирные масла;
ü этилолеат.
В состав комплексных растворителей могут входить глицерин, бензиловый и этиловый спирты, пропиленгликоль и др.
Основными руководящими документами при изготовлении стерильных растворов в аптеках и на фармацевтических производствах являются:
ü ГФ XI и дополнения к ней;
ü методические указания по изготовлению стерильных растворов в аптеках;
ü фармакопейные статьи (ФС);
ü Приказ №214 от 16 июля 1997 г. «О контроле качества лекарственных средств, изготовляемых в аптеках»;
ü Приказ №1026 от 19 октября 1982 г. «Об усилении контроля за санитарным состоянием родильных домов, детски* "лечебно-профилактических учреждений и аптек» и прочая нормативная документация.
Отбор образцов на исследование
Образцы готовых лекарственных средств и медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) отбираются для контроля от каждой серии в количествах не менее 3 и не более 40 (в зависимости от величины партии).
Для посевов используют жидкие среды:
тиогликолевую — для бактериальной микрофлоры;
жидкую среду Сабуро — для грибковой микрофлоры.
Эти питательные среды обладают высокими ростовыми свойствами и обеспечивают рост микроорганизмов при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток. Соотношение объема исследуемой лекарственной формы и среды — 1:10.
Этапы исследования
Прежде всего необходимо определить; не обладает ли лекарственная форма антимикробным действием, во избежание неправильной оценки результатов анализа.
Определение антимикробного действия препарата проводят при отсутствии явных указаний на наличие консерванта или антимикробного вещества.
Используемые в методике тест-штаммы: E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans. Тест-штаммы выращивают на сахарном бульоне при 35-37 оС, 48 часов (Candida albicans — на жидкой среде Сабуро при 20-25 оС, 72 часа). Выращенные культуры разводят стерильным физиологическим раствором до конечной концентрации 1000 клеток/мл; в пробирки вносится по 0,1 мл приготовленной взвеси.
1-я пробирка: 0,1 мл взвеси Staphylococcus aureus + (10:1) тиогликолевая среда и лекарственное средство, t = 35-37 "С, 48 часов;
2-я пробирка: 0,1 мл взвеси Pseudomonas aeruginosa + (10:1) тиогликолевая среда и лекарственное средство; t = 35-37 "С, 48 часов;
3-я пробирка: 0,1 мл взвеси Е. coli + (10:1) тиогликолевая среда и лекарственное средство; t = 35-37 "С, 48 часов;
4-я пробирка: 0,1 мл взвеси Candida albicans + (10:1) жидкая среда Сабуро и лекарственное средство; t=20-25 °С, 72 часа.
Контроли: пробирки с теми же средами, но без лекарственного средства + тест-штаммы (для оценки жизнеспособности тест-штаммов).
Отсутствие роста в опытных пробирках свидетельствует об антибактериальном действии лекарственного препарата.
При исследовании на стерильность для предотвращения антибактериального действия препарат засевается в жидкие среды (тиогликолевая и Сабуро) в соотношении 1:250 или используются инактиваторы, указанные в частных фармакопейных статьях (например, для сульфаниламидов — парааминобензойная кислота, для пенициллинов и цефалоспоринов — фермент пенициллиназа и т. д.). Если препарат обладает выраженным антимикробным действием, то используют метод мембранной фильтрации (см. ГФ XI, с. 189-191): по окончании фильтрации фильтры отмывают стерильным физиологическим раствором и делят на две части, помещая одну в тиогликолевую среду, а другую — в среду Сабуро.
Антибиотики испытываются на стерильность только методом мембранной фильтрации!
Испытание на стерильность лекарственных средств без антимикробного действия
Метод прямого посева
Препарат вносится в соотношении 1:10 в жидкие питательные среды по 2-3 пробирки, которые помещаются в термостат: тиогликолевая среда — t = 35-37 "С, 14 суток; среда Сабуро — t = 20-25 "С, 14 суток. Посевы просматриваются ежедневно!
При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах отбирают в асептических условиях по 0,1 г (мл) каждой единицы и вносят в стерильную колбу объемом 250 мл, где находятся стерильный фосфатный буфер (рН 6,8-7,0), стерильные стеклянные бусы и стерильный эмульгатор. Содержимое колбы подогревают до 41 ±1 °С и встряхивают в течение 30 минут (не более) до получения однородной эмульсии (возможно использование термовстряхивателя). Полученную эмульсию в стерильных условиях переносят в количестве 5,0 мл в колбы, содержащие по 40 мл тиогликолевой среды и среды Сабуро. Инкубация при 35-37 "С для тиогликолевой среды и при 20-25 °С — для среды Сабуро. Посевы просматриваются ежедневно!
Для лекарственных препаратов, разлитых в склянки объемом более 100 мл, можно использовать метод мембранной фильтрации
Учет и интерпретация результатов
Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании срока инкубации (14 дней).
Наличие роста микробов в питательных средах оценивают визуально (макроскопически) по появлению помутнения, пленки, осадка и микроскопически (мазки, окрашенные по Граму).
Если рост через 14 суток отсутствует во всех засеянных пробах, то выдают заключение о том, что препарат (лекарственная форма) стерилен.
Если рост наблюдается хотя бы в одном из посевов макроскопически и подтверждается микроскопически, то посев повторяют: засевают такое же количеств образцов. При этом:
ü если рост отсутствует во всех пробах — посевы стерильные, выдается заключение о том, что препарат стерилен;
ü если рост микробов отмечается хотя бы в одном из посевов и это подтверждается микроскопически (в мазках определяются микроорганизмы, идентичные микробам первого контроля), то выдается заключение, что препарат нестерилен;
ü если во вторичном посеве отмечается рост микробов (хотя бы в одной из проб), но в мазках определяются формы микроорганизмов, отличающиеся от первоначальных, испытание повторяют в третий раз на удвоенном количестве образцов. Если рост отсутствует во всех образцах, то препарат считают стерильным. Если отмечается рост хотя бы в одном из посевов, то препарат нестерилен.
Растворы для инъекций до стерилизации должны храниться не более 3 часов.
Изготовляемые в аптеках растворы для инъекций подвергаются микробиологическому контролю в СЭС выборочно, не реже 2 раз в квартал, а также испытанию на содержание пирогенных веществ — ежеквартально.
Если посев инъекционных растворов (до стерилизации) не делается непосредственно в аптеке, то с момента забора материала до посева должно пройти не более 3 часов.
Приготовление растворов для инъекций проводится в асептических условиях. Асептические условия приготовления лекарственных препаратов регламентируются статьей ГФ XI «Стерилизация», Инструкцией по приготовлению растворов для инъекций в шпеках, Приказом Министерства здравоохранения РФ (№309), Методическими указаниями по изготовлению стерильных раствором в аптеках.
ОМЧ инъекционных растворов до стерилизации — не более 40 сапрофитов в 1 мл (Приложение № 1 к Методическим указаниям по микробиологическому контролю в аптеках № 3182-84).
Растворы для инъекций должны готовиться из лекарственных веществ, полностью отвечающих требованиям фармакопейных статей и других нормативных документов.
Некоторые лекарственные вещества должны обладать повышенной степенью чистоты или подвергаться особой очистке, т. к. могут являться питательной средой для размножения микроорганизмов или оказаться загрязненными на технологических этапах:
гексаметилентетрамин;
глюкоза;
кальция глюконат;
кофеин-бензоат натрия;
натрия цитрат;
кальция хлорид;
магния сульфат и др.
Препараты для инъекций должны храниться в специальных штангласах с притертыми пробками в специальном шкафу. Перед заполнением штангласов новыми порциями препаратов банки и пробки тщательно очищаются и стерилизуются.
Вспомогательные вещества (стабилизаторы, солюбилизаторы, консерванты и др.) также должны соответствовать требованиям нормативной документации.
Растворители
Обычная дистиллированная вода нередко содержит значительное количество живых и мертвых микроорганизмов. Поэтому для приготовления инъекционных растворов применяется дистиллированная вода повышенной чистоты, свободная от микробов и пирогенных веществ — вода для инъекций (см. раздел «Вода» данного методического пособия).
В качестве растворителей применяются также жирные масла: персиковое, абрикосовое, миндальное, — которые обладают малой вязкостью и легко проходят через узкий канал иглы. Могут быть использованы хорошо рафинированные подсолнечное масло и масло земляного ореха (стерилизация масел рассмотрена в разделе «Асептика в фармации» данного методического пособия).
Асептически изготавливают лекарственные формы, не переносящие термической обработки — например, растворы с термолабильными веществами.
Малоустойчивыми системами являются также взвеси и эмульсии, т. к. в них при нагревании резко усиливаются процессы рекристаллизации, флокуляции взвеси и коалесценции (слияние частиц).
Эмульсии — микрогетерогенные системы, в которых и дисперсная фаза, и дисперсионная среда образованы жидкостями, взаимно не растворимыми. Это грубодисперсные системы («масло-вода»). Эмульсии типа «масло-вода» употребляются в медицинской практике как per os, так и парентерально (линименты, жидкие мази, эмульсионные мази).
В этих случаях строжайшее соблюдение асептических условий — единственный путь получения лекарственных препаратов, по своему состоянию весьма близких к понятию стерильных. Это достигается тем, что растворитель или основу для мази, инструменты, посуду стерилизуют отдельно. Термолабильные лекарственные вещества асептически взвешивают и растворяют в стерильном растворителе (иногда с добавлением консерванта) или смешивают со стерильной основой стерильными инструментами и помещают в стерильные отпускные склянки. Термостабильные компоненты лекарственных препаратов стерилизуются. Препараты готовят в асептическом блоке (см. раздел «Асептика в фармации» данного пособия, Приказ МЗ РФ № 309).
Офтальмологические (глазные) лекарственные формы
Данные лекарственные препараты занимают особое место среди лекарств в силу специфики их использования.
Глазные препараты должны быть стерильными, т. к. конъюнктиву глаза необходимо защищать от инфекции. В норме она обмывается слезной жидкостью, содержащей лизоцим, который лизирует грамположительную микрофлору, наиболее часто попадающую на слизистую. При заболеваниях глаз количество вырабатываемого лизоцима часто резко уменьшается.
Инфицирование глаз нестерильными препаратами может привести к тяжелым последствиям, вплоть до потери зрения. С учетом этого предпринимается следующее.
1. При приготовлении глазных капель в асептических условиях скрупулезно соблюдаются все мельчайшие требования асептики.
Проводят стерилизацию глазных лекарственных препаратов, если они выдерживают термическую обработку.
Надо помнить, что при использовании глазных капель при первом открытии флакона, капли могут обсеменяться микроорганизмами. Поэтому целесообразно готовить малые объемы препарата и вводить консерванты для сохранения стерильности (характеристика, механизм действия и требования, предъявляемые к консервантам, изложены в разделе «Асептика» данного методического пособия).
Выбор способа термической обработки глазных капель определяется степенью устойчивости лекарственных веществ в растворах при нагревании. В заводских условиях может использоваться стерилизация фильтрованием.
Глазные мази: основа должна быть стерильной, иначе мазь может стать причиной инфицирования конъюнктивы и слезных протоков.
В качестве основы чаще всего используют вазелин сорта «для глазных мазей», сплав вазелина с ланолином или метилцеллюлозои и другими высокомолекулярными соединениями.
Стерильность надо не контролировать, а обеспечивать!
Условия обеспечения стерильности
Персонал — санитарно-микробиологическая грамотность и ее соблюдение.
Помещение — асептика, ее обеспечение и поддержание.
Оборудование — технологическое соответствие нормативам.
Минимальная исходная микробная контаминация субстанций до стерилизации.
Валидация процесса — критические точки.
Контроль оборудования и процесса.
(!!!) Практическая работа
Задание 1
Для санитарно-бактериологического исследования из аптеки взят на исследование инъекционный раствор глюкозы до стерилизации, спустя час после приготовления.
Проведены следующие виды исследований: ОМЧ, контроль наличия в растворе глюкозы золотистого стафилококка, энтеробактерий, псевдомонад и грибов.
В таблице представлены результаты проведенных исследований.

Показатели	ОМЧ	Энтеробактерии				Сине-гнойная палочка	Плесневые и дрожжевые грибы
		кишеч. палочка		протей	капсул, палочка
Нормативы	до 30 сапрофитов в 1 мл	не должно быть		—	—	—	—
Результаты исследования	25 КОЕ/мл	3 колонии «лак+»		"	"	'
Морфология и тинкториальные свойства выделенного микроба			Грамотрицательная палочка

Сделайте выводы о санитарно-бактериологическом качестве данной партии инъекционного раствора глюкозы до стерилизации.
1. Что такое ОМЧ инъекционного раствора?
2. Что такое сапрофиты и как они могут попасть в раствор в процессе приготовления?
3. Почему среди допустимых 30 сапрофитов не должно быть грамотрицательных микроорганизмов?
4. Что такое пирогенность инъекционного раствора и с чем она может быть связана?
5. Почему требования апирогенности относятся только к инфузионным и инъекционным (парентеральным) препаратам?
6. Откуда кишечная палочка могла попасть в инъекционный раствор?
Задание 2
В аптеке регулярно готовится стерильный раствор глюкозы для новорожденных детей в родильном доме (питание между кормлением грудью).
Для планового санитарно-бактериологического контроля взято 3 флакона (каждый емкостью 200 мл) после стерилизации.
Режим стерилизации — автоклавирование при 120 "С 12 минут.
Контроль стерильности проводился согласно требованиям ВФС 42-1844-88. Выполнены следующие виды исследований:
— из каждого объема проведен посев в тиогликолевую среду в соотношении 1:10 для выявления бактер. флоры (t=37 "С);
— из каждого объема проведен высев на жидкую среду Сабуро в соотношении 1:10 для выявления грибов (t=20—25°С).
Все посевы выдержаны 14 суток.
Результаты учитывались по визуально определяемому помутнению сред.
Видимое помутнение произошло только в тиогликолевой среде на 12-е сутки инкубации. Среда Сабуро оказалась стерильной. Из колбы с помутневшей тиогликолевой средой сделан мазок и высев на чашку с МПА для выявления культуральных особенностей микроорганизма и при необходимости — последующей идентификации по «пестрому ряду».
Свойства выделенного микроорганизма:

Морфология	Тинкториальные свойства	Рост на МПА	Рост по Шукевичу
Палочка	Грамотрицательная	Ползучий	+

Проведите идентификацию микроба на основании представленных в таблице свойств и дайте заключение по стерильности исследуемого препарата.
1. Какая вода используется для приготовления лекарственных стерильных форм (кроме инъекционных и инфузионных)?
2. Почему к лекарственным стерильным формам для энтерального применения не применяются требования апирогенности?
3. Почему данный микроорганизм не погиб при стерилизации?
4. Каким путем данный микроорганизм мог попасть в лекарственную форму?
Задание 3
На бактериологическое исследование взят многокомпонентный инфузионный раствор до стерилизации, приготовленный в больничной аптеке.
Проведены следующие виды исследований: определение ОМЧ, контроль наличия в растворе золотистого стафило­кокка, энтеробактерии, псевдомонад и грибов. Результаты проведенных исследований представлены в таблице (стр. 80).
Идентифицируйте выделенные микроорганизмы на основании представленных в таблице свойств.
Сделайте выводы о санитарно-бактериологическом качестве данной партии инфузионного раствора до стерилизации. 1. Что такое ОМЧ инфузионного раствора?
2. Что такое сапрофиты и как они могут попасть в раствор В процессе приготовления?

Показатели	ОМЧ	Энтеробактерии			Синегнойная палочка	Плесневые и дрожже­вые грибы
		кишеч. палочка	про­тей	капсул, палочка
Норма­тивы	до 30 сап- рофитов в 1 мл	не дол­жно быть	—	—	—	—
Результа­ты иссле­дования	25 КОЕ/мл	3 коло­нии «лак+»	-	-	-	-

Культуральные свойства выде­ленного микроба	1) выпуклые круглые колонии лимонно-желтого цвета, 2) морщинистые крупные плоские се­ровато-белые колонии
Морфология и тинкториальные свойства выделенного микроба	1) грамположительные тетракокки, 2) грамположительные палочки, не­которые содержат споры

3. Почему среди допустимых 30 сапрофитов не должно быть грамотрицательных микроорганизмов?
4. Что такое пирогенность инфузионного раствора и с чем она может быть связана?
5. Почему требования апирогенности относятся только к инфузионным и инъекционным (парентеральным) препаратам?
Задание 4
Для испытания на стерильность в бактериологическую лабораторию поступила партия иммунных препаратов в ампулах (заводская расфасовка) — гипериммунная антисинегнойная плазма.
Так как данный вид иммунных препаратов обладает выраженным антибактериальным действием, перед посевом каждый образец разведен стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:50. Полученные разведения профильтровали через мембранные фильтры и смывы с фильтров засеяли в 3 комплекта сред, каждый из которых состоял из тиогликолевой среды и среды Сабуро. Среды инкубировали в термостате в течение 14 суток при 37 °С (тиогликолевая среда) и 20-25 °С (среда Сабуро).
На 11-е сутки в среде Сабуро визуально отмечен рост. При высеве на плотную среду Сабуро и на МПА обнаружены колонии плесневых грибов.
Проанализируйте ситуацию и дайте заключение по пригодности
1. Как стерилизуются иммунные препараты и почему?
2. Каким образом могли попасть в препарат плесневые грибы?
3. Почему к иммунной плазме предъявляются требования стерильности?
Микробиологическая чистота основного сырья (субстанций) и вспомогательных материалов
(изменения к ГФ XI, 1995 г. при отсутствии других требований в частных фармакопейных статьях)

Категория	Наименование	Требования
1	Основное сырье (субс­танции) для производ­ства стерильных препа­ратов	Не более 102 бактерий и грибов суммарно в 1 г или 1 мл при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Sta­phylococcus aureus и Enterobacteriaceae,
2	Основное сырье (суб­станции) для произ­водства нестерильных лекарственных средств (НЛС)	He более 103 аэробных бактерий и 102 дрожжевых и плеснев грибов в 1г или 1мл при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Enterobacteriaceae,
3	Вспомогательные ма­териалы (мука пшени­чная, тальк, крахмал и др.)	He более 103 аэробных бактерий и 102 дрожжевых и плеснев грибов в 1 г или 1 мл при отсутствии Pseudomonas aeru­ginosa, Staphylococcus aureus, и E. coli, Sal­monella spp.; не более 102 других кишечных бактерий
4	Сырье растительного, животного и природ­ного происхождения, уровень микробной за­грязненности которого невозможно снизить во время технологическо­го процесса	Не более 104 аэробных бактерий, 2.102 дрожжевых и плеснев грибов в 1 г или 1 мл при отсутствии Pseudomonas aeru­ginosa, Staphylococcus aureus и E. coli, Sal­monella spp.; не более 102 других кишечных бактерий
5	Лекарственное расти­тельное сырье, которое подвергается обработке с использованием на­гревания для пригото­вления лекарственной формы	Не более 107 аэробных бактерий и 104 дрожжевых и плеснев грибов в 1 г или 1 мл при отсутствии _________________________________________________________ Е. coli, Salmonella spp.; не более 102 других кишечных бактерий