Многими исследованиями показано: экспрессия miRNA-223 связана с миелоидными клетками в костном мозгу; она повышается при дифференцировке миелоидных предшественников в гранулоциты. Интересны наблюдения за мышами с нокаутом гена miRNA-223, которые оставались здоровыми и у них обнаруживалось повышенное число предшественников гранулоцитов в костном мозгу и зрелых нейтрофилов в циркуляции. Считается, что miRNA-223 вовлечена в негативную регуляцию созревания, но не дифференцировки гранулоцитов. Действие miRNA-223, вероятно, опосредовано через отрицательное влияние другого миелоидного фактора (подобного ELF-1). Этот транскрипционный фактор участвует в пролиферации клеток миелоидного ряда. Функциональные исследования циркулирующих нейтрофилов нокаутных животных показали: miRNA-223 не вовлечена в выход клеток из сосудистого русла, миграцию или фагоцитоз ими Escherichia coli. Однако уменьшение количества miRNA- 223 приводит к усилению кислородного взрыва и цитотоксического ответа на действие грибов Candida albicans. У животных, нокаутных по miRNA-223, спонтанно развиваются воспалительные процессы в легких и наблюдается повышенное разрушение тканей после воздействия эндотоксинов. Обнаруживается быстрое и селективное увеличение экспрессии miRNA-223 в эпителии легких и бронхов после аэрозольного воздействия токсином. Большое количество факторов может регулировать экспрессию miRNA-223 в процессе дифференцировки и созревания гранулоцитов.
Таким образом, накапливается все больше фактов, свидетельствующих о том, что микроРНК представляет собой новый большой класс регуляторных молекул, участвующих во многих физиологических процессах организма. Важную роль микроРНК играют в развитии врожденного иммунного ответа. В основном эти молекулы блокируют или активируют адаптерные молекулы, которые необходимы для проведения сигнала с рецепторов врожденного иммунитета или для регуляции факторов транскрипции, участвующих в дифференциров- ке и созревании различных клеток врожденного иммунитета. Важно, что данные молекулы реализуют свое действие на посттранскрипционном уровне, благодаря чему изучение микроРНК представляет интерес, ибо, вероятно, оно будет способствовать более глубокому пониманию механизмов регуляции врожденного иммунитета. Следует отметить перспективность такого направления исследований, так как с каждым годом возрастает количество данных о возможностях miRNA регулировать врожденный иммунитет. Несомненно: miRNA вскоре станут основой для создания перспективных лекарственных средств, дающих эффект строго направленной коррекции нарушений врожденного иммунитета. Становится очевидной и необходимость разработки новых подходов к синтезу miRNA, изучению механизмов их действия, поиску молекул-мишеней и новых методов тестирования, основанных в первую очередь на принципе ПЦР (см. табл. 6.1).
В настоящее время известно несколько методов для определения экспрессии генов микроРНК в биологических образцах.
Первым методом анализа является Northern blot. Он хорошо изучен и описан, однако довольно трудоемок, а кроме того, существует много ограничений использования образцов. Для определения зрелой микроРНК в пробе общую РНК наносят на 12% денатурирующий полиакриламидный гель. В качестве маркера используют низкомолекулярный олигонуклеотид. После электрофореза пробы помещают на мембрану и проводят гибридизацию с олигонуклеотидными пробами (меченными 32Р изотопом или другой меткой), комплементарными зрелой форме изучаемой микроРНК. Далее мембраны отмывают от несвязавшихся олигонуклеотидных последовательностей и осуществляют детекцию с помощью радиочувствительной пленки (если метка 32Р).
В последнее время для обнаружения молекул микроРНК в биологическом образце используют метод микрочипов (см. выше). Он позволяет исследовать образец на наличие одновременно большого количества молекул микроРНК. Недостаток такого подхода — необходимость содержания в образце больших количеств исследуемой РНК, что не всегда возможно.
Из клеточной культуры, в которой нужно определить микроРНК, выделяют общую РНК. Выделенный материал инкубируют с малыми последовательностями РНК, меченными флуоресцентными метками (Су5, СуЗ и др). Далее меченый образец наносится на микрочип, содержащий ДНК-последовательности известных (по крайней мере 200) молекул микроРНК. После инкубации в течение 14 ч происходит гибридизация и затем планшет отмывается. Результат считывается при помощи флуоресцентного сканера (методически процесс описан выше). По свечению в лунках планшета определяют, какой из 200 образцов микроРНК экспрессируется в пробе.
Новый метод для определения уровня экспрессии генов микроРНК — количественная обратная транскрипция с ПЦР (ОТ-ПЦР) (см. выше). Этот метод имеет высокую специфичность и чувствительность.
Чтобы исследовать микроРНК с помощью ПЦР, необходимо модифицировать последнюю, ибо праймеры в обычной системе для ПЦР имеют тот же размер, что и исследуемая микроРНК. Разработан новый методический подход, основанный на модификации ПЦР, названный miR-Q. Первым шагом в данной методике является встраивание последовательности искомой микроРНК в кДНК с известной последовательностью. Это осуществляется при реакции обратной транскрипции. После проводят ПЦР и детекцию полученного амплификата2.
Вопросы и задания

1. Какие молекулярно-генетические методы используются для решения иммунологических задач?
2. Дайте определение термина «полимеразная цепная реакция» и опишите суть метода.
3. Какие существуют модификации ПЦР, применяемые в иммунологии? Почему они используются?
4. Нарисуйте схему последовательности этапов ПЦР.
5. Опишите трудности, возникающие при постановке ПЦР.
6. Перечислите преимущества ПЦР перед другими методическими подходами.
7. Что такое микрочипы?
8. Какие виды микрочипов вы знаете?
9. Какие иммунологические цели достижимы при использовании микрочипов?
10. Опишите метод получения мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knock-in) генов.
11. Как получить трансгенную мышь?
12. Что такое регуляторные микроРНК?
13. Каким образом регуляторные микроРНК могут быть применены в иммунологических исследованиях?
14. Назовите основные методы для определения микроРНК.
15. Что такое гибридомы?
16. Дайте определение моноклональных антител.
17. Опишите этапы получения гибридом.
18. Проиллюстрируйте принципы метаболической селекции клеток.

2. В подготовке материалов главы 6 приняла участие студентка VI курса МВФ РГМУ Е.А. Акимова.