Для выявления нуклеиновой кислоты-мишени методом гибридизации in situ с применением радиоактивно меченного зонда необходимо, чтобы мишень присутствовала в анализируемом препарате в количестве нескольких тысяч копий. Нередко число аномальных последовательностей в препарате диагностически значимо, но меньше необходимого числа копий мишени, и гибридизация может дать ложноотрицательный результат. Для выявления уникальной нуклеотидной последовательности методом ПЦР достаточно 10 копий матрицы. К преимуществам полимеразной реакции нужно отнести следующее.

1. Метод прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности (от нескольких копий до одного возбудителя в пробе).
2. Специфичность метода приближается к 100%.
3. Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты.
4. Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым наблюдать динамику.
5. Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следова-

тельно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

6. Метод прост в исполнении, возможна его полная автоматиза

ция.

7. Результаты получают через несколько часов, т.е. в течение одного рабочего дня.


Рис. 6.7. Сопоставление результатов ПЦР-РВ с калибровочной прямой: наблюдается рост количества ПЦР-продукта в каждой пробирке (а), определяется по имеющейся калибровке точное исходное количество образца в пробе (б)

Области применения
Метод ПЦР применяется для выявления в клинических образцах вирусов, микобактерий, простейших и бактерий, для обнаружения врожденных и приобретенных генетических нарушений, а также для идентификации личности. Сфера применения ПЦР в диагностике будет постепенно расширяться, поскольку в клинической практике все чаще имеют дело с очень небольшими по размеру биоптатами, получаемыми, например, при эндоскопических исследованиях; или это тонкоигольные аспираты и т.д. В подобных случаях обычный гистологический анализ затруднен. Перечислим, для чего может служить ПЦР.
В иммунологических исследованиях ПЦР чаще всего используется:

• для определения полиморфизма генов, белковые продукты которых участвуют в иммунологических реакциях;
• для определения экспрессии цитокинов, рецепторов цитокинов и других эффекторных молекул;
• для ДНК типирования HLA аллелей и др.

ДНК, выделенную из лимфоцитов, анализируют следующими вариантами ПЦР.

1. ПЦР-праймер со специфической последовательностью (PCR- SSP).
2. ПЦР-олигонуклеотидные пробы со специфической последовательностью (PCR-SSOP).
3. ПЦР-рестрикционный анализ продуктов амплификации (PCR- RFLP).
4. ПЦР-метод обратной гибридизации амплифицированного фрагмента с олигонуклеотидными зондами, фиксированными на мембране или другой твердой подложке (пластине).