Для изучения путей распространения респиратор­ных вирусных инфекций и для разработки мероприя­тий по ^их предупреждению существенное значение имеет обнаружение респираторных вирусов в воздухе жилых и общественных помещений. В связи с этим для развития санитарной вирусологии одним из основных вопросов является разработка эффективных методов вирусологического исследования воздуха. Как извест­но, для изучения микрофлоры воздуха (бактерий и плесневых грибов) были созданы многочисленные приборы и разработаны методы исследования. Мно­гие из этих приборов с соответствующими модифика­циями были позднее применены и для обнаружения вирусов в воздухе.
Индикация вирусного аэрозоля складывается из ряда этапов: 1) концентрации вируса из воздуха;
2) транспортировки проб в лабораторию; 3) культи­вирования вирусов на восприимчивых животных, культурах ткани или куриных эмбрионах; 4) иденти­фикации выделенных агентов.
Специфическими для санитарной вирусологии яв­ляются вопросы концентрации вирусного агента из воздуха, тогда как вопросы транспортировки, выде­ления вирусов и их идентификация не отличаются от общепринятых в вирусологии методических приемов.
Так как вирусы, как правило, находятся в воздухе закрытых помещений лишь в небольших количествах, то разработка и усовершенствование методов их об­наружения проводилась в экспериментальных усло­виях в герметизированных аэрозольных камерах, в ко­торых создавались высокие концентрации вирусного аэрозоля путем диспергирования вируссодержащей суспензии. В связи с наибольшей изученностью и про­стотой в обнаружении основные исследования прово­дились на различных штаммах вируса гриппа. Эти ис­следования шли в двух основных направлениях:
а) обнаружение вирусного аэрозоля путем зара­жения восприимчивых животных при вдыхании содер­жащего вирус гриппа воздуха;
б) улавливание вирусного аэрозоля при помощи различных методов микробиологического исследова­ния воздуха с последующим культивированием выде­ленного вируса.
В 40—50-х годах проводились довольно многочис­ленные исследования с аэрозолями вируса гриппа. Для обнаружения вируса гриппа, диспергированного в гер­метизированных аэрозольных камерах различного типа, широко использовалась методика заражения восприимчивых животных (хорьков, а позднее белых мышей). В этих экспериментах наличие и количество вируса гриппа в воздухе аэрозольных камер опреде­лялось по степени инфицирования (поражению легоч­ной ткани) и проценту гибели животных, которых по­мещали на определенные промежутки времени в ка­меру (С. М. Островская и др., 1938; В. И. Вашков и др., 1953; 3. И. Мерекалова, 1953; Wells, 1941; Loosly е. а., 1941; Lester, 1948; Borecky, 1955, и др.).
В этих довольно многочисленных исследованиях была продемонстрирована возможность обнаружения вируса гриппа в аэрозоле и были сделаны первые ша- гп по пути количественного определения содержания вирусов в воздухе аэрозольных камер. При этом были достигнуты определенные успехи в изучении вирус­ного аэрозоля в капельной фазе, а также в определе­нии эффективности обеззараживания воздуха в отно­шении вируса гриппа в экспериментальных условиях. Более подробно этот вопрос изложен в разделе «Обеззараживание воздуха закрытых помещений». Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что биологиче­ский метод обнаружения вируса гриппа в воздухе нельзя признать достаточно чувствительным. Так, на­пример, методом инфицирования белых мышей вирус гриппа определялся в воздухе камеры в течение 1'/2 ч после его диспергирования, тогда как при отборе проб бактериоуловителем Речменского с последующим за­ражением куриных эмбрионов вирус мог быть обна­ружен через 9 ч после создания аэрозоля.
При помощи восприимчивых животных определя­ются, как правило, лишь довольно высокие концент­рации вируса гриппа в воздухе. При этом полученные результаты во многом зависят от степени дисперсно­сти вирусного аэрозоля и соответственно от распре­деления инфекционного агента в дыхательных путях экспериментальных животных и специфической и не­специфической восприимчивости используемых живот­ных, которая в зависимости от ряда условий (возраст и пол животных, характер питания, сезонность и т. д.) колеблется в широких пределах.
Учитывая недостатки биологического метода обна­ружения и титрования вирусного аэрозоля, а также тот факт, что многие респираторные вирусы человека при аэрозольном инфицировании не вызывают забо­леваний лабораторных животных, исследования пре­дыдущих лет были целиком направлены на изучение пригодности различных приборов для улавливания вирусного аэрозоля и сравнительной оценки эффек­тивности отдельных приборов.
Положительной стороной индикации вирусного аэрозоля при помощи различных приборов является возможность концентрировать вирус из определенных объемов исследуемого воздуха и, следовательно, опре­делять содержание вируса в единице объема воздуха.
Проведенные в нашей стране и за рубежом иссле­дования позволили выделить наиболее эффективные
методические приемы улавливания вирусного аэро­золя.
В многочисленных работах по созданию и исследо­ванию вирусных аэрозолей показано, что наиболее благоприятные условия для улавливания вирусного аэрозоля п сохранения инфекционных свойств вируса создаются при использовании методов и приборов для исследования воздуха, в которых улавливание и кон­центрирование вируса осуществляется в жидкой сре­де. Менее пригодны для этой цели методические приемы и приборы с использованием плотных пита­тельных сред или фильтров различных марок. При этом необходимо оговориться, что, хотя был предло­жен ряд приемов, способствующих повышению эф­фективности этих приборов и методов, тем не менее улавливание в жидкой среде обеспечивает наиболее высокие и стабильные результаты улавливания вирус­ного аэрозоля.
Как уже отмечалось выше, улавливание вирусного аэрозоля в жидкой среде при соответствующем под­боре улавливающей жидкости позволяет обнаружи­вать даже небольшие концентрации вируса в воздухе. В этих условиях достигается, с одной стороны, мини­мальная инактивация уловленного вируса, хотя сам переход из аэрозольного состояния в суспензию явля­ется неблагоприятным для биологического объекта фактором. С другой стороны, максимальное количе­ство уловленного вируса находится в суспензии, что значительно упрощает проведение последующих виру­сологических исследований и соответственно повы­шает возможность обнаружения вируса в пробе.
Уже в первой работе, посвященной выделению вируса гриппа из воздуха аэрозольной камеры и инактивации его при помощи УФ-излучения, Wells и Brown (1936) использовали для обнаружения вирус­ного аэрозоля аэроцентрифугу Уэллсов, в которой взвешенные в воздухе частицы улавливались в жид­кой среде. Последующее определение вируса гриппа осуществлялось путем интраназального заражения лабораторных животных.
Близкая по конструкции аэроцентрифуга Шафира была позднее использована для улавливания аэрозо­ля вируса гриппа А. И. Шафиром с сотр. (1957) и Г. И. Карпухиным (1962).
В последующих исследованиях вирусных аэрозо­лей выявилась тенденция использовать для индика­ции вирусного аэрозоля наиболее эффективные при­боры, предназначенные для изучения микрофлоры воздуха и особенно применяемые в экспериментах с бактериальными аэрозолями. К этим приборам сле­дует отнести широко применяемые за рубежом для аэробиологических исследований различные типы импинджеров, а в нашей стране — бактериоуловитель Речменского и прибор ПОВ-1.
Один из наиболее эффективных приборов исследо­вания бактериальных аэрозолей — бактериоуловитель Речменского был применен X. Л. Галикеевым (1956),
А. Ф. Визитиу (1962) и для обнаружения аэрозоля вируса гриппа в капельной фазе в экспериментальных условиях. Позднее В. В. Влодавец и соавт. (1960— 1965), сопоставляя эффективность улавливания аэро­золя вируса гриппа различными приборами, показали, что наиболее высокими улавливающими свойствами обладает бактериоуловитель Речменского. В сравни­тельных исследованиях по обнаружению вируса грип­па при использовании различных улавливающих жид­костей было установлено, что для максимального вы­деления вируса наиболее пригодной средой оказался сахарный бульон. Последующее выделение вируса гриппа из улавливающей жидкости производилось пу­тем заражения куриных эмбрионов по общепринятой методике.
Высокая эффективность бактериоуловителя Реч­менского была также показана в исследованиях
А. А. Закомырдина (1964), который в эксперимен­тальных условиях применял этот прибор для обнару­жения аэрозоля вирусов ларинготрахеита и атипич­ной чумы птиц.
При проведении дальнейших исследований с ви­русными аэрозолями показано, что бактериоуловитель Речменского может быть с успехом применен для об­наружения аэрозоля аденовируса как в воздухе аэро­зольной камеры (В. В. Влодавец и др., 1964), так и в воздухе палат инфекционной детской клиники. При проведении этих исследований установлено, что для выделения вирусов из воздушной среды наиболее це­лесообразно использовать в качестве улавливающей жидкости питательные среды, используемые для под­держания культуры ткани: среду № 199 или гидроли­зат лактальбумина.
При помощи бактериоуловителя Речменского бы­ли проведены эксперименты по обнаружению мини­мальных концентраций вируса гриппа в капельной фазе аэрозоля (С. Я. Гайдамович и др., 1963), что по­служило предпосылкой для дальнейших исследований по выделению респираторных вирусов из воздуха больничных помещений.
В работе Ф. Ф. Ламперт и Р. А. Дмитриевой (1969) прибор Речменского был использован для обнаруже­ния аэрозоля бактериофага в воздухе помещений при изучении путей распространения воздушных потоков и оценки вентиляции в зданиях повышенной этажно­сти. Позднее в Ленинградском филиале Всесоюзного института медицинского приборостроения был разра­ботан прибор ПОВ-1, механизм улавливания кото­рого близок к прибору Речменского. Проведенные в институте общей и коммунальной гигиены имени А. Н. Сысина исследования продемонстрировали его эффективность в отношении улавливания вирусного аэрозоля как в экспериментальных условиях, так и при отборе проб воздуха в отделении детских респи­раторных вирусных инфекций. Однако наиболее ши­рокое применение нашел этот прибор в многочислен­ных исследованиях по обнаружению аэрозоля бакте­риофага Т1 кишечной палочки, который искусственно создавался в закрытых жилых и общественных поме­щениях (главным образом в больницах различного профиля) для изучения процессов воздухообмена и соответственно возможных путей распространения инфекционного агента токами воздуха.
При проведении разнообразных эксперименталь­ных исследований с вирусными аэрозолями зарубеж­ные авторы широко пользуются импинджерами. При этом в герметизированных аэрозольных камерах со­здаются высокие концентрации аэрозоля, а отбор проб при помощи различной конструкции импиндже- ров позволяет определить наличие и концентрацию вируса в небольших объемах воздуха. Ввиду того что импинджеры, как правило, характеризуются низкой производительностью (от 3 до 9 л/мин), они оказа­лись совершенно непригодными для исследования воздуха помещений на наличие вирусных аэрозолей.
Вместе с тем они характеризуются высокой эффектив­ностью улавливания вирусного аэрозоля. Иными сло­вами, импинджеры являются приборами узконаправ­ленного действия, предназначенными для изучения искусственно создаваемых вирусных аэрозолей.
В течение 1950—1960 гг. были проведены много­численные экспериментальные исследования, главным образом в США и Великобритании, в которых отбор проб воздуха и определение концентрации вирусного аэрозоля проводились почти исключительно при по­мощи различных типов импинджеров. Так, Roscbury с соавт. сообщили об использовании капиллярного импинджера для определения вируса менингопневмо- нии и возбудителя пситтакоза в воздухе аэрозольных камер. Последующее титрование вируса осуществля­лось путем интрацеребрального введения улавливаю­щей жидкости белым мышам.
В последние годы для этой цели был использован также многоступенчатый жидкостный импактор Мея, который позволяет улавливать на различных ступенях прибора аэрозоли различной дисперсности. Этот при­бор был применен Larson с соавт. (1973) как для улавливания бактериальных аэрозолей, так и для об­наружения аэрозоля вируса венесуэльского лошади­ного энцефаломиелита. Более подробных сведений о возможности использования многоступенчатого импинджера Мея для улавливания вирусного аэро­золя не имеется.
Ввиду того что в настоящее время для бактерио­логических анализов воздуха широкое применение на­ходят щелевые приборы с улавливанием бактериаль­ных аэрозолей на чашки Петри с питательным ага­ром, ряд авторов предприняли попытки использовать эти приборы также для обнаружения вирусного аэро­золя. В нашей стране для этой цели был применен щелевой прибор Кротова, в котором улавливание ви­русного аэрозоля осуществляется в чашках Петри с мясопептонным. агаром. Элюцию вируса с поверхно­сти агара производили мясопептонным бульоном или физиологическим раствором (В. В. Влодавец и др., 1960; Г. С. Яковлева и др., 1965), а затем получен­ными суспензиями заражали куриные эмбрионы. Од­нако, как показали наши исследователи (В. В. Вло­давец и др., 1960), вирус гриппа определялся в этих
случаях в значительно меньших количествах, чем при помощи прибора Речменского. Возможно, что часть вируса гриппа, и в первую очередь тонкодисперсная фракция аэрозоля, .не задерживается или плохо за­держивается на поверхности агара или не весь улов­ленный вирус гриппа удается элюировать, или воз­можно также, что в результате всех этих процедур часть вируса гриппа инактивируется.
Другой прием был использован при улавливании аэрозоля бактериофага ТЗ кишечной палочки и ви­руса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (Kuehne е. а., 1961). Для этой цели в щелевой прибор помещали чашки Петри с желатиновой средой. После отбора проб воздуха чашки помещали в термостат при температуре 37°С для растворения желатины, которая затем использовалась при последующих виру­сологических исследованиях. Указанная методика мо­жет быть применена для обнаружения устойчивых к нагреванию вирусов.
Описанные выше способы недостаточно удобны и эффективны. В связи с этим стали разрабатываться также и методические приемы, которые, с одной сто­роны, повышали эффективность улавливания вирус­ного аэрозоля, а с другой — способствовали сохране­нию инфекционных свойств уловленного вируса. Для этой цели был использован метод, основанный на на­несении на поверхность агара тонкого слоя специаль­ной смазки, увеличивающей содержание вируса в смыве с агара.
Одной из первых работ в этом направлении было исследование Jensen (1964), который проводил ши­рокое изучение вирусных аэрозолей при помощи шестиступенчатого каскадного импактора Андерсена. Для обнаружения различных вирусов (аденовирусов, вирусов Коксаки, гриппа Синдбиса, основакцины) на каждой ступени каскада помещали чашку Петри с агаром, поверхность которого смазывали 0,3 мл сте­рильного снятого молока. После отбора пробы воз­духа смыв с поверхности агара делали 3 мл раствора Хенкса, после чего полученной суспензией заражали монослой клеток культуры ткани.
Это направление нашло дальнейшее развитие в исследованиях Thomas (1970), который разработал так называемый метод «адгезивных» улавливающих
поверхностей. Задача автора заключалась в подборе такой композиции смеси, смазывающей поверхность агара веществ, которая: а) в условиях отбора проб воздуха в течение одного часа сохраняла бы адгезив­ные свойства, б) растворялась бы в воде при 37°С,
в) не оказывала бы токсического действия ни на улавливаемый вирус, ни на культуру ткани.
На основании многочисленных экспериментов с 21 различным веществом была предложена комбини! рованная смазка, состоящая из смеси равных частей насыщенного раствора сахарозы и глицерина, в кон торую добавляли 10% бычий сывороточный альбумин! в количестве 0,1%. Проведенные эксперименты с аэрозолями вируса осповакцииы и полиомиелита I, II и III типов показали, что чашки с этой адгезивной] поверхностью могут быть с успехом использованы как в щелевом приборе, так и в шестиступенчатом при-] боре Андерсена.
Большая группа методов, которые применяются! для вирусологического исследования воздуха, основы­вается на использовании различных фильтров для концентрации вирусного аэрозоля. Для этой цели были предложены аллонжи, наполненные ватным тампоном, мембранные фильтры и фильтры из ткани Петрянова, а также растворимые фильтры из желати­новой пены и альгината натрия.
Как при улавливании вирусного аэрозоля на по­верхности плотных питательных сред, так и при отбо-: ре проб различными фильтрами вирусные частицы или задерживаются в теле фильтра (хлопчатобумажная вата, а также растворимые фильтры), или же кон­центрируются на поверхности фильтров (мембранные фильтры и фильтры из материала Петрянова), после: чего они переводятся в суспензию. Все последующие: вирусологические исследования проводятся с этой cy^J спензией.
Механизм улавливания вирусных аэрозолей раз­личными фильтрами изучен явно недостаточно. Мож­но отметить, что при отборе проб воздуха при помощи мембранных фильтров и фильтров из ткани Петря­нова на их поверхностях создаются значительные электростатические заряды, которые способствуют осаждению и задержке частиц аэрозоля. Как пока­зали эксперименты с радиоактивными аэрозолями, глубина проникновения частиц тонкодисперсного аэрозоля в тело мембранного фильтра не превышает 0 3 мкм. Иными словами, подавляющее большинство частиц аэрозоля при отборе проб осаждается на по­верхности фильтра, благодаря чему создаются благо­приятные условия для последующей элюции уловлен­ного вируса.
Все предложенные фильтры и фильтрующие мате- рилы могут быть использованы для улавливания ви­русного аэрозоля с последующей элюцией уловлен­ного вируса при помощи различных жидкостей, что позволяет повысить эффективность перехода вирусов в суспензию и уменьшить степень его инактивации. Возможность использования разных фильтров была продемонстрирована при улавливании вирусов гриппа и ящура в экспериментальных условиях.
Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что осно­ванные на фильтрации методы имеют ряд недостат­ков. Так, общим недостатком этой группы методов является то, что часть вируса прочно задерживается па поверхности, в теле фильтра или на волокнах, не переходя в элюат. При этом надо иметь в виду также возможность инактивации многих вирусов па сухой поверхности фильтров в момент отбора проб воздуха, а также в период до обработки фильтра смачиваю­щей жидкостью.
Можно считать, что все методы исследования, ос­нованные на фильтрации воздуха через волокнистые, мембранные и растворимые фильтры, более пригодны для улавливания устойчивых во внешней среде виру­сов, тогда как для индикации аэрозолей респиратор­ных вирусов они имеют ограниченное применение.
Более благоприятные условия для сохранения биологической активности уловленных из воздуха ви­русов создаются в приборе Киктенко.
Бактерпоуловитель Киктенко представляет собой аллонж, наполненный тонковолокнистой стеклянной ватой. Для увеличения улавливания вирусного аэро­золя ватный тампон смачивают смесью равных объе- мов 3% раствора желатины и вазелинового масла, ¿шесте с тем следует отметить, что последующее от­мывание фильтра требует больших количеств жидко­сти, что приводит к значительному разведению улов­ленного вируса.
В последние годы все больше внимания уделяется приборам, позволяющим в течение короткого проме­жутка времени исследовать большие объемы воздуха. При этом создается возможность концентрировать патогенные микроорганизмы из воздуха в небольших объемах жидкости, что увеличивает возможность об­наружения респираторных вирусов, которые нахо­дятся в воздухе в небольших количествах.
Среди ряда приборов, предложенных для исследо­вания больших объемов воздуха, наибольший интерес представляет прибор LVS (large volume sampler, т. е. пробоотборник для больших объемов), который рас­считан на исследование до 10 м³ воздуха в 1 мин (Gerone е. а., 1966). Улавливание микроорганизмов в этом приборе осуществляется посредством электро­преципитации на вращающийся диск, который во вре­мя отбора проб смачивается тонким слоем жидкости. Состав улавливающей жидкости может быть изменен в зависимости от задачи и объекта исследования; для повышения эффективности исследований подбирается наиболее благоприятная для изучаемого микроорга­низма улавливающая жидкость.
В приборе LVS достигается высокая концентрация биологического аэрозоля: она примерно в 100 раз пре­вышает концентрацию бактериального или вирусного аэрозоля на единицу объема улавливающей жидкости по сравнению с таким распространенным для иссле­дования воздуха прибором, как стеклянный импинд- жер. Вместе с тем необходимо отметить, что отдель­ные исследователи считают, что высокое напряжение электрического поля в приборе и коронный разряд, при помощи которого заряжаются частицы аэрозоля, оказывают неблагоприятное действие на жизнеспособ­ность многих микроорганизмов.
При смазывании поверхности агара «адгезивными» смесями уменьшается испарение влаги и значительно увеличивается продолжительность отбора проб и со­ответственно объем воздуха, исследуемого щелевым прибором, что позволило Thomas (1974) улавливать этим методом вирус оспы из воздуха палат инфек­ционного госпиталя.
Проведенные нами сравнительные исследования с использованием различных приборов показали, что наиболее высокими улавливающими способностями в
отношении вируса гриппа в капельной фазе аэрозоля обладает бактериоуловитель Речменского. Несколько ниже эффективность барботирующего прибора Верши- горы, аэроцентрифуги Шафира и прибора Дьяконова. Еще ниже улавливающая способность бактериоулови- теля Киктенко и щелевого прибора Кротова. Наименее эффективными в отношении улавливания и обнаруже­ния аэрозоля вируса гриппа оказались растворимые фильтры из желатиновой пены и альгината натрия.
Следует отметить, что в последние годы процесс изготовления желатиновых фильтров был значительно усовершенствован фирмой «Сарториус» (Гёттинген). Так, по данным Keller и соавт. (1974), эти фильтры характеризуются высокой улавливающей способно­стью — задерживают 99,95% частиц аэрозоля разме­ром от 0,5 до 1,5 мкм, а также хорошей растворимо­стью. Можно полагать, что они могут быть значитель­но более эффективными в отношении улавливания ви­русного аэрозоля.
Не касаясь каждого прибора и метода в отдельно­сти, следует отметить, что на степень обнаружения рес­пираторных вирусов в воздухе аэрозольной камеры оказывают влияние такие факторы, как задержка ча­стиц вирусного аэрозоля, разведение различными объе­мами жидкости в разных приборах и при последующих манипуляциях, различие в степени инактивации виру­са на отдельных этапах, начиная от отбора проб воз­духа и до заражения куриных эмбрионов. Поэтому, оценивая каждый прибор-уловитель, следует строго дифференцированно определять его улавливающую способность, исходя из того что эффективность улав­ливания вирусного аэрозоля складывается из ряда перечисленных выше факторов, а также зависит от биологических свойств и в первую очередь от рези­стентности изучаемого вируса.