Косвенная (непрямая) ДНК-диагностика используется при заболеваниях, ген которых достаточно точно картирован, т.е. локализован в конкретном узком участке определенной хромосомы. Важно подчеркнуть, что косвенная ДНК-диагностика может проводиться даже в тех случаях, когда какая-либо другая информация о гене болезни, помимо его хромосомного расположения, отсутствует (т.е. когда неизвестны структура и размер гена, характер мутаций в нем, кодируемый геном белок и т.д.).
Сущность косвенной ДНК-диагностики заключается в анализе наследования у больных и здоровых членов семьи полиморфных генетических маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области и, следовательно, сцепленных с геном болезни. В качестве таких маркеров выступают участки ДНК, существующие в виде нескольких возможных аллельных вариантов и различающиеся у разных лиц по тем или иным структурным особенностям (например, по составу нуклеотидов или по числу копий динуклеотидных СА-повторов). Благодаря вариабельности состава таких маркерных участков ДНК обычно бывает возможно дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера при анализе ДПК обследуемого лица. Сцепление конкретного маркера с геном болезни означает, что данный маркер располагается в непосредственной близости от патологического гена, поэтому маркер и ген болезни после кроссипговера остаются в составе одного хромосомного сегмента и передаются потомству как единое целое (рис. 28). Таким образом, благодаря анализу полиморфных генетических маркеров удается проследить в ряду поколений наследование каждой из родительских хромосом.

Рис. 28. Различная степень сцепления исследуемых хромосомных локусов и их рекомбинация при кроссинговере М - мутантный аллель, N - нормальный аллель, А и В - генетические маркеры, расположенные в исследуемой хромосомной области. Исследуемый ген тесно сцеплен с маркером В, поэтому после кроссинговера мутация остается на одной хромосоме с маркерным аллелем В1, а нормальный ген - с аплелем В2. Маркер А является более отдаленным, поэтому исходные аллели данного маркера и исследуемого гена в результате кроссинговера расходятся по разным хромосомам.
Пример косвенной ДНК-диагностики аутосомно- доминантного заболевания показан на рис. 29.

Рис. 29. Косвенная ДНК-диагностика аутосомно-доминаит- I юго заболевания
Черным цветом обозначены больные лица, белым - клинически здоровые, серым цветом - клинически здоровый родственник, являющийся асимптомным носителем мутантной хромосомы. Исследована ДНК родственников из 2 нижних поколений родословной. I? нижней части рисунка показана электрофореграмма с результатами исследования изучаемого (СА)п-маркера (каждая дорожка геля соответствует индивиду в родословной, расположенному сверху от дорожки). Справа от электрофореграммы указаны размеры ал- мелей (в парах оснований). Другие объяснения даны в тексте.
Па первом этапе необходимо определить, какой из аллелей изучаемого маркера сцеплен с мутантным геном в данной семье у заведомо больных лиц (на рисунке 29 это отцовский аллель размером 210 п.о., поскольку именно он всегда обнаруживается у больных лиц 11-2, П-З, III- 1 и Ш-2 - дорожки 1, 3, 4 и 6). Дальнейший анализ наследования данного аллеля позволяет проследить передачу патологического участка отцовской хромосомы, содержащего мутантный ген. Так, на рисунке видно, что указанный 210-нуклеотидый аллель передался от больного Н-З (дорожка 6) его клинически здоровому сыну Ш-4, входящему в группу риска (дорожка 7); на основании этого делается вывод о том, что сын Ш-4 унаследовал от отца патологическую хромосому и является носителем мутантного гена (положительный результат косвенной ДНК-диагностики). Напротив, сын Ш-3 (дорожка 5) унаследовал от больного отца П-2 (дорожка 4) другой аллель изучаемого маркера размером 206 и.о., расположенный на «здоровой» хромосоме и сцепленный с нормальным геном; следовательно, у пего результат ДНК- диагностики отрицательный (носительство мутантного гена отвергнуто).
Как видно из приведенной схемы, косвенная ДНК диагностика обладает 3 основными недостатками.

1. Для ее проведения требуется анализ ДНК нс скольких членов семьи, как правило, из 2-3 поколений:, таким образом в неполных (неинформативных) семьях такая диагностика невозможна. Косвенная ДНК-диагно стика может оказаться невозможной также в том случае, когда отец и мать имеют одинаковые аллели маркера, что не позволяет дифференцировать генетическое про похождение родительских хромосом у детей (в этой сп туации говорят о неинформативности маркера).
2. Для проведения косвенной Д1ПС-диагноста ки у лиц из группы риска необходимо предварительно диагностировать заболевание хотя бы у одного индинн дуума в родословной; таким образом косвенный подход неприменим для ДНК-диагностики единичных (спорадических) случаев заболевания.
3. При проведении косвенной ДНК-диагности- ки всегда существует вероятность ошибки, связанная с возможной рекомбинацией в мсйозе между геном болез- I (и и исследуемым маркером, в результате чего «патоло- ¦ ический» маркерный аллель и ген болезни у потомка разойдутся по разным хромосомам. Величина такой ошибки прямо пропорциональна расстоянию между маркерным локусом и изучаемым геном: чем ближе они друг к: другу на хромосоме (т.е. чем теснее сцеплены между собой), тем меньше вероятность их расхождения вслед- c. зие кроссинговера. Для известных на сегодня генетических маркеров, используемых в косвенной ДНК-диагностике наследственных заболеваний, вероятность расхождения с геном болезни в мейозе (т.е вероятность ошибки) не превышает 1-5%; таким образом, точность косвенной ДНК-диагностики болезни составляет обычно^ 95%.

На практике для повышения точности и инфор- м пивности косвенной ДНК-диагностики обычно используют несколько маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области. Таким образом, для каждой и t lt;ромосом можно установить и графически реконструировать последовательную серию аллелей изучаемых

1. пктических маркеров. Такая комбинация аллелей разни 11 ых локусов на одной хромосоме носит название гап- юитп.

Косвенная ДНК-диагностика не ограничивается

2. gt; 111.ко заболеваниями, ген которых картирован, но не | шовлен. В настоящее время косвенная ДНК-диагпо-

111. ка I нироко используется также при заболеваниях, гены iTt Ч'ых идентифицированы, но имеют большой размер п I южную молекулярную организацию, в связи с чем

непосредственное определение мутаций в них чрезвычайно затруднено. Если ген заболевания известен, при проведении косвенной ДНК-диагностики могут использоваться как внешние сцепленные маркеры, так и внут- ригенные маркеры, непосредственно входящие в состав кодирующей области или интронов. В качестве примеров заболеваний с установленными генами, при которых с успехом применяется косвенная ДНК-диагностика, можно назвать атаксию-телеангиэктазию, гепатоленти- кулярную дегенерацию, различные формы аутосомно- рецессивных прогрессирующих мышечных дис грофий и др.
Косвенный ДНК-анализ может применяться в качестве дополнительного диагностического метода у лиц из группы риска при отрицательных результатах традиционного мутационного скрининга. Так, папример, в семьях, имеющих одного больного ребенка с мышечной дистрофией Дюшенна/Бекера, пренатальная ДНК- диагностика болезни у плода при последующих беременностях может включать ряд последовательных молекулярных тестов [van Essen A. et al., 1997]. На первом этапе у пробанда проводится скрининг наиболее частых делеций в гене дистрофина с использованием мультиплексной ПЦР, а после обнаружения конкретной деле- ции исследуется ее наличие у плода. При отрицательном результате этого первого этапа ДНК-анализа далее может быть проведен Саузерн-блоттинг, позволяющий выявить ряд делеций, дупликаций или точковых мутаций, не выявляемых с помощью мультиплексной ПЦР; для поиска структурных или точковых мутаций может использоваться также анализ кДНК дистрофина, полученной из образцов тканей пробанда (лимфоциты, мы шечные биоптаты), SSCP-анализ и другие скрининговые методы исследования кодирующей области гена. Наконец, при невозможности обнаружения конкретных нуклеотидных изменений в гене проводится косвенная ДНК- диагностика с вне- или внутригенными маркерами, позволяющая оценивать сегрегацию патологического участка Х-хромосомы у матери, больного ребенка и плода и тем самым с высокой вероятностью определять генетический статус плода.
Данный пример хорошо иллюстрирует важнейший принцип молекулярно-генетической диагностики наследственных заболеваний - необходимость рационального сочетания различных методов, четкую последовательность выбора тех или иных процедур ДНК-ана- лиза, определяемую особенностями строения гена и типичным спектром мутаций, характерным для каждого заболевания.