Лабораторная работа 3-5 Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека

  Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл- верографина. Затем клетки ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 2-меркаптоэтанол (5х10-5 М), с конечной концентрацией 1х106 клеток в 1 мл.
  1. В каждую лунку 24-луночного планшета помещают 1 мл клеточной взвеси МНК и инкубируют в течение 60 мин при 37 °С для получения фракции прилипающих моноцитов. Надосадочную жидкость, содержащую лимфоциты, удаляют.
  2. В опытные лунки с прилипшими моноцитами добавляют ЛПС (Е. coli), растворенный в RPMI 1640 до конечной концентрации 10 мкг/мл, а в контрольные лунки — равный объем среды RPMI 1640.
  3. Через 24 ч культивирования при 37 °С в атмосфере 5% С02 проводят центрифугирование при 400 g в течение 8 мин при комнатной температуре; надосадочную жидкость, содержащую цитокины, собирают, стерилизуют фильтрованием (0,2 мкм) и хранят при -20 °С.
  4. Супернатант, полученный таким способом, можно использовать для определения концентрации различных цитокинов (провос- палительных, противовоспалительных, колониестимулирующих факторов (КСФ) и др.), секретируемых МНК. Оценку цитокинов проводят методами биологического тестирования (см. гл. 7) или ИФА (см. гл. 4). Кроме того, можно определять содержание оксида азота, противомикробных пептидов и других биологически активных молекул.

Источник: под ред. Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской., «Иммунология : практикум : учеб, пособие» 2010

А так же в разделе «  Лабораторная работа 3-5 Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека »