предыдущая
к содержанию
следующая

  Постановка реакции выявления АОК (метод Н. Йерне)

  Предварительная подготовка занятия (для группы из 10—12 человек)
  1. Иммунизация мышей эритроцитами барана. Мышей (4 особи) иммунизируют внутривенно 0,5 мл 2% суспензии отмытых эритроцитов барана за 4—5 дней до опыта.
  2. Приготовление агара (1,4% раствор). 7 г сухого агара Дифко помещают в колбу с 500 мл дистиллированной воды и расплавляют на водяной бане, постоянно помешивая. Жидкий агар разливают в лотки. После того как агар застынет, его разрезают на кубики 1x1 см, которые завертывают в марлю и промывают проточной водой в течение 5—7 дней.
  3. Перед занятием (перед опытом) готовят 0,7% раствор агара. Для этого 10 мл предварительно расплавленного агара (1,4%) смешивают с 8 мл дистиллированной воды и добавляют 2 мл 10-кратного раствора Хэнкса и 2 капли 7,5% раствора бикарбоната натрия (pH 7,0—7,2). Получают 8—10 чашек агара.

  1. Агар разливают по пробиркам по 2 мл и хранят в водяной бане при 45 °С (за час до опыта).
  2. Чашки Петри помещают в сушильный шкаф (80—90 °С).
  3. Готовят 10% взвесь эритроцитов барана (предварительно отмыв их 3 раза физиологическим раствором).

Непосредственная постановка реакции
  1. Забивают мышей и фиксируют их на столике.
  2. Выделяют селезенку.
  3. Готовят суспензию клеток в 3 мл среды 199 и подсчитывают число ядросодержащих клеток в суспензии.
  4. Готовят разведение клеток с концентрацией 50х106 и ЮхЮ6 в 1 мл.
  5. Готовят смесь агара, эритроцитов барана и клеток селезенки. Для этого в пробирки с 2 мл агара, находящиеся в водяной бане при 45 °С, добавляют 0,1 мл 10% суспензии эритроцитов барана и 0,1 мл суспензии клеток (конечная концентрация клеток — 5х106 и 1х106).
  6. Разливают смесь в чашки Петри. Смесь из пробирок выливают на теплые чашки Петри. Быстрыми круговыми движениями смесь равномерно распределяют по дну чашки. Чашки ставят на горизонтальный столик. Дают агару застыть.
  7. Инкубируют чашки Петри в термостате при 37 °С в течение 60 мин.
  8. Разведение комплемента: сухой комплемент морских свинок разводят средой 199 (на 1 ампулу 5 мл среды, получают 20% раствор).
  9. В каждую чашку Петри аккуратно добавляют по 3 мл комплемента.
  10. Инкубируют чашки Петри в течение 30 мин при 37 °С.
  11. Оценивают реакцию.
  12. Подсчитывают число бляшкообразующих клеток на чашку и пересчитывают на 1 млн клеток и на всю селезенку.
  13. Микроскопия бляшек: находят бляшку с лизированным участком и бляшкообразующей клеткой в центре.
  14. Для улучшения контрастирования бляшек производят окраску препаратов (состав красителя: 10 мл 2% раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте, 10 мл 5% Н202, 80 мл дистиллированной воды).
  15. Для сохранения бляшек чашку Петри заливают 10% раствором формалина.

предыдущая
к содержанию
следующая

Источник: под ред. Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской., «Иммунология : практикум : учеб, пособие» 2010

А так же в разделе «  Постановка реакции выявления АОК (метод Н. Йерне) »