Основные требования, предъявляемые к ДНК-зондам для FISH, следующие: высокая степень очистки, эффективность включения модифицированных нуклеотидов от 50 % и выше, размер меченых фрагментов от 150 до 700 п. н. Вышеперечисленные показатели существенно влияют на эффективность гибридизации и на отношение сигнал: фон.
Ниже мы приводим хорошо зарекомендовавший себя способ проведения реакции ник-трансляции, а также простые способы оптимизации размеров меченых фрагментов и оценки эффективности мечения зонда.

1. Мечение ДНК-зондов методом ник-трансляции Маточные растворы

1. 1 М трис. Растворить 121,1 г триса в 800 мл H2O. Довести pH до необходимого значения добавлением концентрированной HCl. Довести объем раствора до 1000 мл.
2. 1 М MgCl2. Растворить 203,3 г MgCl2 х 6H2O в 800 мл. H2O. Довести объем до 1 л. Разлить на порции и простерилизовать автоклавированием.
3. 1 М дитиотрейтол (ДТТ). Растворить 3,09 г ДТТ в 20 мл 0,01 М ацетата натрия, pH 5,2. Простерилизовать фильтрованием, разлить на порции по 1 мл и хранить при -20 °С.
4. p-меркаптоэтанол. Обычно выпускается в виде 14,4 М раствора. Хранить в темной бутыли при +4 °С.
5. 3 М-ацетат натрия. Растворить 408,1 г ацетата натрия х 3 H2O в 800 мл H2O. Довести pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Довести объем до 1 л. Разлить на порции и простерилизовать автоклавированием.
6. 0,5 М ЭДТА. Добавить 186,1 г динатриевой соли ЭДТА х 2 H2O к 800 мл H2O. Интенсивно размешать на магнитной мешалке. Довести pH до 8,0 с помощью NaOH (~ 20 г NaOH). Довести объем раствора до 1000 мл. Разлить на порции и простерилизовать автоклавированием.

Состав реакционной смеси

• 5 мкл 10 х буфера для ник-трансляции (0,5 М Tris-HCl, pH 7,8; 50 мМ MgCl2; 0,5мг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА);
• 5 мкл 0,1 М дитиотрейтола (ДТТ);
• 5 мкл 0,1 М р-меркаптоэтанола;
• 4 мкл смеси нуклеотидов (0,5 мМ дАТФ; 0,5 мМ дГТФ; 0,5 мМ дЦТФ; 0,1 мМ дТТФ);
• 2 мкл 1мМ био-11-дУТФ (или диг-11-дУТФ, флуоресцин-12-дУТФ и др.);
•               мкл (1мкг) ДНК-пробы;
•               мкл (10 ед.) ДНК-полимеразы I E.Coli;
•               мкл (оптимальное количество мкл (см. Протокол 5.2) рабочего рас

твора ДНКазы I*;

•               мкл бидистиллированная вода до конечного объема 50 мкл.

* Маточный раствор ДНКазы I: 1 мг ДНКазы I растворить в 1 мл буфера — 0,15 М NaCl и 50 % глицерин, хранить раствор при -20 °С.
Рабочий раствор ДНКазы I: готовится разведением маточного в 1000 раз: непосредственно перед использованием 1 мкл маточного раствора добавить к 1 мл холодной (+4 °C) бидистиллированной воды и перемешать.
Протокол 5.1

1. Приготовить реакционную смесь в эппендорфовской пробирке на льду, ферменты добавлять в последнюю очередь.
2. Смесь перемешать встряхиванием пробирки и быстро осадить центрифугированием.
3. Реакционную смесь инкубировать на водяной бане при +15 °С в течение двух часов или при +10 °C четыре часа.
4. Остановить реакцию добавлением 5 мкл 0,5 M ЭДТА, рН 8,0. Выполнение этого пункта не обязательно в том случае, если за п. 3 будет без перерыва следовать п. 5.
5. Добавить к реакционной смеси раствор ДНК-носителя (50 мкг)*, затем добавить 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,5 и 3-5 объемов охлажденного до -20 °С 96%-го этанола.
6. Выдержать смесь в течение не менее 30 мин при - 70 °С или 3 часов при - 20 °С. При - 20 °С смесь можно оставить на ночь или более длительный срок.
7. Осадить ДНК центрифугированием при 15 тыс. об/мин в течение 15-20 мин (лучше использовать центрифугу с охлаждением, +4 °С).
8. Осторожно удалить надосадочную жидкость пипеткой.
9. Добавить к осадку 300-400 мкл охлажденного до - 20 °С 70%-го этанола, слегка покачать пробирку несколько раз, не переворачивая, и повторно центрифугировать при 15 тыс. об/мин в течение 10 мин.
10. Удалить надосадочную жидкость пипеткой и высушить осадок при +37 °С. Сухой осадок становится прозрачным.
11. Растворить ДНК в 40 мкл бидистиллированной воды. Конечная концентрация полученной меченной ДНК составляет 20-25 нг/мкл.
12. Приготовленный раствор меченой ДНК можно хранить при - 20 °С в течение нескольких месяцев.

* В качестве ДНК-носителя рекомендуется использовать фрагментированную ДНК спермы лосося (размер фрагментов от 400 до 1000 п.н.).

2. Оптимизация размеров меченых фрагментов Протокол 5.2

1. Приготовить реакционные смеси для ник-трансляции (см. п. 1-2 Протокола 5.1), добавив в них разный объем рабочего раствора ДНКа- зы1 — 1; 2,5; 5 и 10 мкл.
2. Провести реакцию как описано в п. 3 Протокола 5.1.
3. Отобрать из каждой пробирки аликвоту 10 мкл (200 нг) в новые пробирки, а пробирки, в которых проводилась реакция на время тестирования убрать в холодильник — температура не выше +4 °С.
4. Денатурировать ДНК, поместив пробирки в кипящую водяную баню на 5 мин.
5. Сразу перенести пробирки в лед. Через 2-3 мин добавить в них 1/10 объема раствора, содержащего: 25 % фиколл, 0,25 % ксиленциа- нол, 0,25 % бромфеноловый синий.
6. Быстро нанести образцы на 2%-й агарозный гель вместе с маркерами размера ДНК (размеры от 50 до 2000 нуклеотидов) и провести электрофорез, пока бромфеноловый синий не пройдет 2/3 геля. Электрофорез во избежание ренатурации молекул ДНК проводить при напряжении 40-60 В и силе тока 25-30 мА, желательно в холодном месте.
7. Окрасить гель водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и проанализировать в проходящем УФ-свете. Сравнить размеры ДНК образцов и ДНК маркера. Оптимальный размер зондов составляет 150-700 нуклеотидов.
8. Завершить мечение ДНК-зондов в пробирках с оптимальным размером фрагментов (см. п. 5-12 Протокола 5.1).
3. Оценка эффективности мечения ДНК-зонда Растворы

1. Раствор 20xSSC, pH 7,0 — 3 M NaCl, 0,3 M цитрат Na.
2. Раствор 4xSSC, pH 7,0 — к 200 мл раствора 20xSSC добавить 800 мл дистиллированной воды.
3. Раствор для отмывок — 4xSSC, 0,2%-й Tween-20.
4. Блокирующий раствор — 1 % блокирующий реагент (Boehringer Mannheim), 4xSSC, 0,2%-й Tween-20. Блокирующий реагент можно заменить БСА (3 %) или обезжиренным сухим молоком (5 %).
5. Инкубационный раствор — 1%-й блокирующий реагент (Boehringer Mannheim), 4xSSC, 0,1%-й Tween-20. Блокирующий реагент можно заменить БСА (1 %) или обезжиренным сухим молоком (5 %), содержащий конъюгат стрептавидин (авидин)-щелочная фосфатаза в разведении, рекомендуемом фирмой-изготовителем.
6. Раствор для щелочной фосфатазы — 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5; 0,1 M NaCl; 10 мM MgCl2.
7. Раствор для детекции — раствор для щелочной фосфатазы, содержащий субстраты NBT и BCIP. К 10 мл буфера для щелочной фосфатазы добавить 45 мкл маточного раствора NBT и 35 мкл маточного раствора BCIP.
8. Маточный раствор NBT (нитротетразолий синий) — 75 мг/мл в диметилформамиде.
9. Маточный раствор BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат) — 50 мг/мл в 50%-м диметилформамиде (при использовании калиевой соли BCIP) или воде (при использовании натриевой соли BCIP).

Протокол 5.3

1. Приготовить в лунках иммунологического планшета или на парафильме серию разведений ДНК-зонда от 1 нг/мкл до 0,1 пг/мкл. Для этого нанести в лунки иммунологического планшета или на парафильм по 9 мкл, для первого разведения 9,5 мкл, дистиллированной воды; добавить к первой капле 0,5 мкл раствора меченого зонда (см. п. 11, Протокол 5.1), аккуратно перемешать пипетированием; затем из первой капли перенести 1 мкл во вторую каплю и т. д.
2. По 1 мкл из каждого разведения нанести на нейлоновую мембрану и высушить.
3. Облучить мембрану на УФ-трансиллюминаторе в течение 2-3 мин.
4. Поместить мембрану в пластиковую кювету или чашку Петри и залить блокирующим раствором, инкубировать 15 мин при 37 °С.
5. Раствор осторожно слить и залить в кювету инкубационный раствор. Инкубировать 30 мин при 37 °С или согласно рекомендациям производителя.
6. Инкубационный раствор слить и отмыть фильтр при покачивании кюветы в трех сменах раствора для отмывок, по 5 мин в каждой, температура отмывок на 2 °С выше инкубационной.
7. Инкубировать фильтр 5 мин при комнатной температуре в растворе для щелочной фосфатазы.
8. Раствор слить и инкубировать фильтр в растворе для детекции, в темноте при комнатной температуре, до появления четкого синего окрашивания точек. Время окрашивания варьирует от 15 минут до 3 часов.
9. Промыть фильтр в дистиллированной воде и высушить.
10. ДНК-зонд рекомендуется использовать для гибридизации, если 1 пг его определяется данным тестом, однако в случае высокоповторяющихся последовательностей ДНК (сателлитные и альфоидные повторы) выявление 5 пг зонда можно считать достаточным.