Состав гибридизационной смеси и температурный режим являются параметрами, от которых зависит специфика гибридизации молекул ДНК-зонда с ДНК-мишени (хромосомной ДНК). Поэтому в зависимости от нуклеотидного состава и числа копий исследуемой последовательности ДНК, а также задач, поставленных исследователем, могут изменяться: состав гибридизационной смеси (добавление или исключение некоторых компонентов — декстран сульфат, неионные детергенты и т. д.), содержание денатурирующего реагента — формамида (от 0 до 60 %) или концентрация солевых буферов (от 2 до 0,1xSSC) и температурный режим проведения гибридизации (от +37 до +42 °С).
В данной главе приведены два Протокола, которые наиболее часто используются для диагностических целей в нашем центре.

1. Гибридизация in situ с ДНК-зондами на основе высоко-(уме- ренно) повторяющихся последовательностей и уникальных последовательностей, не содержащих большого количества интерспер- сных повторов.

Растворы

1. Состав гибридизационного раствора для гибридизации сател- литных и альфоидных повторов * (конечная концентрация формамида 55 %):

10 мкл — общий объем ¦              7 мкл — гибридизационный буфер №1

•               мкл — ДНК-зонд (10-30 нг)
•               мкл — ДНК-носитель (20-50-кратный избыток по сравнению с

ДНК-зондом)

•               мкл дистиллированной воды до 10 мкл

*Проведение гибридизации в данном растворе при температуре +37 °С соответствует условиям средней жесткости, позволяющим выявлять специфические для отдельных хромосом участки альфоидных последовательностей ДНК (исключение — хромосомы 13 и 21, 14 и 22, имеющие гомологичные участки альфоидной ДНК, подробнее см. [235]).

2. Состав гибридизационного раствора для гибридизации умеренных повторов (конечная концентрация формамида 50 %):

10 мкл — общий объем

• 7 мкл — гибридизационный буфер №2
•               мкл — ДНК-зонд (20-40 нг)
•               мкл — ДНК-носитель (50-кратный избыток по сравнению с ДНК зонда)
•               мкл дистиллированной воды до 10 мкл.

3. Состав гибридизационного раствора для гибридизации уникальных последовательностей (конечная концентрация формамида 50 %):

10 мкл — общий объем

• 7 мкл — гибридизационный буфер №2
•               мкл — ДНК-зонд (100-200 нг)
•               мкл — ДНК-носитель (500-кратный избыток по сравнению с ДНК

зонда)

•               мкл дистиллированной воды до 10 мкл.

Приготовление гибридизационных буферных растворов
Буфер №1 — смешать в пробирке 10 г декстран сульфата, 1мл 20xSSC, 5,5 мл деионизированного формамида и довести объем бидистиллированной водой до 7 мл; смесь растворить при +40 °С на шейкере; профильтровать через фильтр с диаметром пор 45 мкм. Готовый буфер хранить при -20 °С.
Буфер №2 — приготовление и состав такие же, как для буфера №1, за исключением объема формамида — 5 мл.
Протокол 5.9

1. Приготовить в эппендорфовской пробирке гибридизационный раствор, смешав растворы меченой пробы (проб) и ДНК-носителя с нагретым до +37 °С гибридизационным буфером.
2. Денатурировать пробу, поместив пробирку с гибридизационным раствором на кипящую водяную баню на 5-10 мин.
3. Быстро перенести пробирку на лед. Не рекомендуется оставлять денатурированный зонд на льду более 30 мин.
4. Нанести гибридизационный раствор на предварительно нагретые до 37-38 °С препараты — по 10 мкл под покровное стекло 22x22 мм, и заклеить по периметру края покровных стекол резиновым клеем. Поместить препараты в предварительно нагретую до +37-38 °С влажную камеру.
5. Инкубировать препараты 12-18 часов (ночь) при +37-38 °С. Примечания

1. Если целью исследования является одновременное выявление двух и более последовательностей ДНК, в гибридизационный раствор следует добавить одновременно несколько проб, меченных по-разному модифицированными нуклеотидами. Концентрацию ДНК-носителя при этом пропорционально увеличить.
2. Если общий объем растворов меченой пробы и ДНК-носителя будет больше 30 % объема гибридизационного раствора, то один из них или оба (растворы меченой пробы и ДНК-носителя) высушить с помощью лиофильной сушки или в термостате при +37 °С.
2. Супрессорная гибридизация in situ

Метод используется для гибридизации с большеразмерными ДНК- зондами, содержащими значительное количество интерсперсных повторяющихся последовательностей (ИПП) (например, геномными последовательностями, клонированными в космидах или YAC, цельнохромосомными и локус-специфическими пробами разной природы).
Основное отличие данного Протокола от Протокола 5.9 — дополнительный этап предгибридизации (супрессии) ДНК-зонда с конкурентной ДНК, что необходимо для предотвращения перекрестной гибридизации зонда с ДНК хромосом, не являющейся мишенью, но содержащей ИПП. В качестве конкурентной ДНК можно использовать фрагментированную тотальную геномную ДНК (размер фрагментов 400-800 п. н.) или ДНК высокоповторяющейся фракции генома - Cotl, последнее более эффективно.
Состав гибридизационного раствора (конечная концентрация форма- мида 50 %):
10 мкл — общий объем

• 7 мкл — гибридизационный буфер № 2 см. Протокол 5.9
•               мкл — ДНК-зонд (50-100 нг)
•               мкл — конкурентная ДНК (1-5 мкг, до 8 мкг)
•               мкл — ДНК-носитель (суммарное количество конкурентной ДНК

и ДНК-носителя должно составлять 10 мкг)

•               мкл дистиллированной воды до 10 мкл

Примечание
Общее количество ДНК в гибридизационном растворе не должно превышать 30 мкг.
Протокол 5.10

1. Приготовить в эппендорфовской пробирке гибридизационный раствор[††].
2. Денатурировать пробу, поместив пробирку с гибридизационным раствором на кипящую водяную баню на 5-10 мин.
3. Быстро перенести пробирку в термостат на +37 °С и инкубировать 10-50 мин. Продолжительность инкубации зависит от количества ИПП в ДНК-зонде, размера ДНК-мишени (хромосомы или хромосомного участка) и степени гомологии исследуемой ДНК с ДНК других участков хромосом.
4. Нанести гибридизационный раствор (10 мкл под покровное стекло 22x22 мм), на предварительно нагретые до 37-38 °С препараты, заклеить по периметру края покровных стекол резиновым клеем и поместить их во влажной камере в термостат.
5. Инкубировать препараты 12-18 часов (ночь) при +37-38 °С.
3. Постгибридизационные отмывки препаратов

Постгибридизационные отмывки необходимы для удаления с препаратов молекул ДНК-зонда не специфически связавшихся с хромосомной ДНК. От точности проведения этого этапа во многом зависит общий результат диагностики, так как неспецифическая «фоновая» гибридизация затрудняет, а иногда делает невозможным корректный анализ препаратов после FISH. С целью выявления на хромосомах или в интерфазных ядрах последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК-зонда, отмывки проводят при той же концентрации формамида, что и гибридизацию, а температура на 5 °С выше, чем гибридизационная. О возможных вариантах и целях отмывок разной степени жесткости см. в работах [533, 818]. Ниже мы приводим стандартный Протокол постгибридизационных отмывок.
Протокол 5.11

1. Осторожно удалить резиновый клей.
2. Поместить препараты в стакан с раствором 50 % (55 %) форма- мид — 2xSSC, pH 7,0, при +43 °С. Через 3-5 мин аккуратно удалить покровные стекла.
3. Отмыть препараты в трех сменах раствора формамид 50 % (55 %) — 2xSSC pH 7.0 по 5 мин в каждом при +43 ° С.
4. Отмыть препараты в трех сменах раствора 2xSSC по 5 мин в каждом, при +43 °С.
5. Отмыть препараты 5 мин в растворе 0,2xSSC, при +43 °С. Примечания

1. Для отмывок используется раствор формамида той же концентрации, которую применяли для гибридизации. Формамид деионизировать не обязательно, pH при необходимости подвести до 7,0 концентрированной HCl.
2. Отмывки рекомендуется проводить в стаканах или кюветах для проводок на водяной бане-качалке.
4. Флуоресцентная детекция гибридных молекул

Гибридные молекулы можно выявлять с помощью различных систем иммунохимической детекции, используя флуорохромы-детекто- ры разных цветов, это делает возможным выявление одновременно нескольких последовательностей ДНК в одной клетке. Ниже мы приводим два хорошо зарекомендовавших себя способа детекции гибри- дизационных сигналов. Первый — «одноцветный» (Протокол 5.12) используется для детекции гибридных молекул после гибридизации in situ, проведенной с ДНК-зондом, меченным биотином, второй — «двухцветный» (Протокол 5.13) для детекции продуктов гибридизации, проведенной одновременно с двумя ДНК-зондами (детекция биотина и дегоксигенина).
Растворы

1. Раствор 4xSSC, pH 7,0 — к 200 мл раствора 20xSSC добавить 800 мл дистиллированной воды.
2. Раствор для отмывок — 4xSSC, 0,2 %-й Tween-20.
3. Блокирующий раствор — 1%-й блокирующий реагент (Boehringer Mannheim), 4x SSC, 0,1%-й Tween-20. Блокирующий реагент можно заменить БСА (3 %) или обезжиренным сухим молоком (5 %).
4. Раствор для детекции — 1 %-й блокирующий реагент (Boehringer Mannheim) 4xSSC, 0,1%-й Tween-20. Блокирующий реагент можно заменить БСА (1 %) или обезжиренным сухим молоком (5 %), содержащий соответствующий конъюгат-детектор. Раствор приготовить в эппендорфовской пробирке за 20-30 мин. до использования, хорошо перемешать и оставить до момента нанесения при комнатной температуре в темноте, перед нанесением раствор еще раз перемешать и быстро осадить центрифугированием.

Протокол 5.12

1. Препараты из раствора 0,2xSSC, стряхнув с них жидкость, поместить на нагревательный столик.
2. Нанести на препараты по 150 мкл блокирующего раствора и накрыть покровными стеклами 24x50 мм (при использовании стекол другого размера соответственно изменить объем наносимого раствора).
3. Инкубировать препараты 20-30 мин во влажной камере в термостате при +37 °С.
4. Осторожно (стряхиванием) удалить покровные стекла.
5. Влажные препараты немедленно поместить в прогретую до +37 °С влажную камеру или на нагретый до этой же температуры нагревательный столик и нанести на них по 80-100 мкл раствора для детекции, содержащего конъюгат авидин-FITC в концентрации 5 мкг/ мл, сверху накрыть покровными стеклами 24x50 мм. Препараты инкубировать 30-40 мин во влажной камере в термостате при +37 °С.
6. Осторожно удалить покровные стекла, отмыть препараты в трех сменах раствора для отмывок по 5 мин в каждой смене, при +43 °С, при покачивании.
7. Быстро перенести препараты во влажную камеру или на нагревательный столик и нанести на них 80-100 мкл раствора для детекции, содержащего биотинилированный антиавидин D в концентрации 5 мкг/мл, накрыть покровными стеклами 24x50 мм. Препараты инкубировать 30-40 мин во влажной камере в термостате при +37 °С.
8. Повторить п. 6 данного Протокола.
9. Повторить п. 5 данного Протокола. Продолжительность инкубации можно уменьшить до 20-25 мин.
10. Повторить п. 6 данного Протокола.
11. Сполоснуть препараты в стакане с 14xSSC, 0,1%-й Tween-20PBS, а затем в стакане с дистиллированной водой. Можно использовать только дистиллированную воду — две смены.
12. Дегидратировать препараты в серии спиртов (70 %, 80 %, 96 % этанол) по 5 мин в каждом.
13. Высушить препараты на воздухе.

Примечания

1. Все процедуры отмывок препаратов рекомендуется проводить в стаканах или кюветах для проводок на водяной бане-качалке.
2. При проведении всех этапов детекции поверхность препаратов не должна подсыхать.
3. Этапы Протокола, начиная с п. 5, рекомендуется проводить в затемненном помещении. Категорически недопустима работа в ярко освещенном помещении.
4. Если нет необходимости в усилении гибридизационных сигналов (например, при использовании в качестве зонда сателлитных последовательностей ДНК), этапы иммунохимической амплификации флуоресцентных сигналов (пп. 7-9), можно исключить. После п. 6 перейти к выполнению пп. 11-13.

Протокол 5.13
1-6. См. п. 1-6 Протокола 5.12.

7. Быстро перенести препараты из последней смены отмывок во влажную камеру или на нагревательный столик, и нанести на них по 80-100 мкл раствора для детекции, содержащего биотинилированный антиавидин D в концентрации 5 мкг/мл и мышиные моноклональные антитела к дигоксигенину в разведении, рекомендуемом фирмой-изго- товителем, накрыть покровными стеклами 24x50 мм. Препараты инкубировать 30-40 мин во влажной камере при +37 °С.
8. См. п. 6 Протокола 5.12.
9. Не давая препаратам полностью высохнуть, нанести по 80-100 мкл раствора для детекции, содержащего конъюгат авидин-FITC в концентрации 5 мкг/мл и кроличьи антитела к IgG мыши, конъюгированные с TRITC, в разведении, рекомендуемом фирмой-изготовителем, накрыть покровными стеклами 24x50 мм. Препараты инкубировать 30 мин во влажной камере при +37 °С.
10. См. п. 6 Протокола 5.12.
11. На влажные препараты нанести по 80-100 мкл раствора для детекции, содержащего козьи антитела к IgG кролика, конъюгированные с TRITC, в концентрации, рекомендуемой фирмой-изготовителем. Накрыть покровными стеклами 24x50 мм, инкубировать 20-30 мин во влажной камере при +37 °С.
12. См. п. 7 Протокола 5.12.

13-15. См. пп. 11-13 Протокола 5.12.
Примечание
Условия проведения процедуры см. в Протоколе 5.12.

1. Окраска и заключение препаратов

После детекции гибридных молекул препараты окрашивают флуоресцентными красителями и заключают в фотозащитный раствор. Первая процедура позволяет наблюдать флуоресцентные сигналы непосредственно на окрашенных хромосомах, интерфазных ядрах, клетках и т. д., что облегчает анализ полученных результатов. Вторая — защищает флу- орохромы от выгорания. Окраска и заключение могут быть проведены раздельно или одновременно. В последнем случае краситель добавляют в фотозащитный раствор. Нам кажется более удобным второй способ, один из вариантов которого мы приводим ниже.
Если для детекции гибридных молекул использовали FITC, в фотозащитный раствор добавляют растворы пропидиум йодида и DAPI. Если проводили «двухцветную» детекцию, используя FITC и TRITC, в фотозащитный раствор следует добавить только раствор DAPI.
Растворы

1. Фотозащитный заключающий раствор:

• к 0,23 г 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октана (DABCO) добавить 1мл 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5 и перемешать покачиванием или пи- петированием;
• добавить 9 мл 95-99%-го глицерина;
• растворить смесь при +70 °С (на шейкере или пипетировани- ем); когда раствор станет гомогенным, оставить его на несколько часов или на ночь при комнатной температуре;
• подогреть раствор до +40 °С и профильтровать через фильтр с диаметром пор 45 мкм;
• расфасовать раствор по 1-2 мл и хранить при -20 °С.

2. Раствор DAPI.

Маточный раствор: 1 мг/мл на дистиллированной воде, хранить при -20 ° С.

3. Раствор пропидиум йодида.

Маточный раствор: 1 мг/мл на дистиллированной воде, хранить при -20 °С.

4. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий DAPI: (0,51 мкг/мл в заключающем растворе):

• 0,5-1 мкл маточного раствора красителя осторожно нанести на стенку эппендорфа с 1 мл заключающего раствора; быстро осадить центрифугированием;
• осторожно 5-6 раз перемешать пипетированием и быстро осадить центрифугированием;
• раствор хранить при -20 °С до полугода;
• перед нанесением на препарат выдержать раствор 20-30 мин в темном месте, при +37 °С.

5. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий пропидиум йодид: 0,5-1 мкг/мл в заключающем растворе; приготовление см. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий DAPI.
6. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий пропидиум йодид и DAPI: добавлять оба красителя в заключающий раствор одновременно в указанных выше концентрациях; приготовление см. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий DAPI.

Протокол 5.14

1. Нанести на препараты по 40-45 мкл заключающего раствора, содержащего флуоресцентный краситель (красители), накрыть покровными стеклами размером 24x50 или 24x60 мм (при использовании стекол другого размера соответственно изменить объем наносимого раствора).
2. Окрашивать препараты 20-30 мин при комнатной температуре или ночь в холодильнике при +4 °С.

Примечание
Заключение проводить сразу после завершения процедуры флуоресцентной детекции, когда препараты высохнут, см. Протокол 5.12, 5.13

2. Микроскопия

Анализ препаратов после FISH проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного набором соответствующих светофильтров. В таблице приведены возможные варианты наборов одиночных, двойных и тройных светофильтров, которые можно использовать для визуализации флуорохромов, описанных в данном разделе.

Флуорохром	Цвет флуорохрома	Возбуждающий фильтр	Светоделительная пластинка	Запирающий фильтр
DAPI	голубой	365	395	397
Пропидиум йодид	темно-красный	546	580	590
Пропидиум йодид	ярко-красный	460-490	510	520
FITC	желто-зеленый	460-490	510	520
TRITC	розовый	460-490	510	520
TRITC	красный	546	580	590
FITC/TRITC	желто-зеленый/ розовый	485 и 546	440/505	515-530 и 580-630
DAPI/ FITC/TRITC	зеленый/ желтый/ малиновый	400/495/570	410/505/585	460/530/610

5. Хранение препаратов после FISH

Заключенные в фотозащитный раствор препараты следует хранить при +4 °С в закрытой коробке. При правильном проведении всех этапов FISH проанализированные препараты могут храниться 2-3 года и более. При необходимости, если морфология хромосом (интерфазных ядер, клеток) сохранилась, а флуоресцентные сигналы стали слабыми, можно аккуратно бритвой или скальпелем снять покровные стекла, отмыть препараты в нескольких сменах дистиллированной воды, дегидратировать в серии спиртов и усилить гибридизационные сигналы (пп. 5-12 Протокола 5.12), а затем заключить препараты как описано в Протоколе 5.14.