1. Метод QFQ

Для получения Q-окраски хромосом используют акрихин и его производные (атебрин, акрихин-иприт, акрихин-пропил). Существует несколько вариантов метода, незначительно отличающихся по результатам. В отечественных лабораториях этот метод не нашел широкого применения для анализа метафазных хромосом, однако его используют при анализе Y-хроматина в ядрах буккального эпителия.
Растворы
Стандартный фосфатный буфер (рН 6,7) или цитратно-фосфатный буфер Мак-Ильвейна (рН 5,4).
Протокол 3.9 [64]

1. Краситель развести в одном из буферных растворов. Рекомендуемые концентрации: 5 мкг/мл, 50 мкг/мл или 1-5 мг/мл.
2. Окрашивать препарат под покровными стеклами или в бюксе 10-20 мин.
3. Промыть в нескольких сменах буферного раствора или проточной водой.
4. Заключить препарат в буфер или воду.
5. Анализировать на люминесцентном микроскопе при длине волны 450-500 нм.

Примечания

1. При использовании низких концентраций красителя можно анализировать препарат непосредственно в растворе красителя без промывания.
2. Заключающий раствор можно приготовить из смеси буфера с глицерином в соотношении 1:1.
2. Метод QFH

Рисунок флуоресценции при окрашивании хромосом флуорохро- мом Hoechst 33258 с последующим контрастированием актиноми- цином D принципиально не отличается от Q-рисунка, получаемого с помощью акрихина за исключением интенсивно светящихся гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9 и 16, темных при традиционном QFQ-рисунке. Преимущества QFH-рисунка заключаются и в том, что Hoechst значительно превосходит акрихин по яркости, а контрастирование окраски антибиотиком актиномицином D дает очень четкую и стабильную картину дифференциальной флуоресценции. Хотя этот метод применяется для окраски хромосом человека только в нашей лаборатории, предлагаемый вариант достоин широкого применения в клинической цитогенетике и особенно в пренатальной диагностике.
Растворы

1. Насыщенный солевой буферный раствор, рН 7,2.
2. Раствор флуорохрома Hoechst 33258.

Маточный раствор красителя на дистиллированной воде в концентрации 1мг/мл (может быть использован в течение года при хранении при +4 °С).
Рабочий раствор: приготавливать из маточного на насыщенном солевом буферном растворе, рН 7,2, в концентрации 0,5 мкг/мл. Использовать в течение 2-4 недель.

3. Актиномицин D (аналоги: актиномицин С, дактиномицин) растворить в концентрации 0,2-0,3 мг/мл в буфере состава: 1 мМ Na2HPO4, 1мМ ЭДТА.
4. Заключающий раствор: цитратно-фосфатный буферный раствор, рН 4,2, смешать с глицерином в соотношении 1:1 (по объему).

Протокол 3.10 [16]

1. Инкубировать препараты 10-20 мин в насыщенном солевом буферном растворе, рН 7,2 (время инкубирования свежеприготовленного препарата можно сократить до 3-5 мин).
2. Окрашивать 12-20 мин в растворе красителя Hoechst 33258.
3. Инкубировать в свежей порции буферного раствора 10-20 мин.
4. Высушить препарат и нанести 2 капли раствора актиномицина, накрыть каждую каплю чистым сухим покровным стеклом и поместить в защищенное от света место на 15-20 мин.
5. Смыть покровные стекла и промыть препарат проточной дистиллированной водой. Высушить.
6. Нанести на препарат под каждое покровное стекло по 1 капле заключающего раствора. Избыток жидкости аккуратно удалить фильтровальной бумагой.
7. Анализировать на люминесцентном микроскопе при длине волны 360-390 нм. При использовании микроскопов серии «Люмам» возбуждающий светофильтр «УФС 6-3» или 6-5 в комплекте со светофильтром СЗС-24, запирающий ЖСЗ+БС8 (голубая пластинка опак- иллюминатора).

Примечания

1. Всю процедуру окрашивания проводить в бюксах из темного стекла или обернутых в черную бумагу.
2. Качество дифференциальной окраски зависит от рН растворов и времени хранения препаратов до и после окрашивания. Анализ хромосом лучше проводить на препаратах, хранившихся при +60 °С 1-12 часов или 2-7 дней при +37 °С до окрашивания и 2-5 дней при +4 °С после окраски, избегая таким образом «выцветания» дифференциальной окраски.
3. Окрашенные препараты оберегать от воздействия света.
4. Использовать нефлуоресцирующее иммерсионное масло, при его отсутствии — глицерин.

Глицерин не должен иметь собственной люминесценции.