Предгибридизационная обработка препаратов

  Накопленный нами опыт показывает, что для FISH оптимально использовать свежие препараты, приготовленные за двое суток до гибридизации и не подвергавшиеся каким-либо обработкам или окраскам. Однако при необходимости можно использовать окрашенные ранее препараты, мягко (дистиллированная вода, спирты, ксилол) отмытые от красителей, и препараты, приготовленные за несколько месяцев (до двух-трех лет) до гибридизации. Важным условием успешного проведения исследования является минимальное количество цитоплазмы и клеточного детрита на препарате. Ниже приведена легко воспроизводимая методика обработки препаратов перед гибридизацией. Ее можно использовать для предгибридиза- ционной обработки препаратов всех типов клеток, приготовленных прямыми методами или после культивирования, а также мазков клеток буккального эпителия и крови.
Растворы
  1. Раствор РНКазы А.

Маточный раствор — 10 мг РНКазы А растворить в 1 мл 2х SSC, поместить пробирку в кипящую водяную баню на 10 мин и охладить до комнатной температуры. Расфасовать по 15 мкл и хранить раствор при - 20 °С.
  1. Рабочий раствор РНКазы (готовить непосредственно перед употреблением) — к 985 мкл раствора 2хSSC добавить 15 мкл маточного раствора РНКазы А.
  2. Раствор 20xSSC, pH 7,0 — 3 M NaCl, 0,3 M цитрат Na.
  3. Раствор 2xSSC, pH 7,0 — к 100 мл раствора 20xSSC добавить 900 мл дистиллированной воды.
  4. Раствор 10xPBS, pH 7,0.
  5. Раствор А: в 900 мл дистиллированной воды растворить 16,02 г Na2HPO4x2H2O и 73,84 г NaCl. Раствор Б: в 200 мл дистиллированной воды растворить 2,76 г NaH2PO4 и 16,56 г NaCl. Довести рН раствора А до 7,0 с помощью раствора Б.
  6. Раствор пепсина (использовать пепсин с активностью 30004000 ед., например, Sigma, P 6886).

Маточный раствор — 10%-й водный раствор пепсина на дистиллированной воде. Расфасовать по 100 мкл и хранить при -20 °С.
  1. Рабочий раствор — непосредственно перед использованием 60100 мкл маточного раствора пепсина добавить к 100 мл 0,01 М HCl. Раствор перемешать.
  2. 0,01 М HCl — к 100 мл предварительно нагретой до +37 °С дистиллированной воды добавить 85 мкл концентрированной HCl. Раствор перемешать.
  3. Раствор параформальдегида (1%-й или 4%-й), готовить непосредственно перед употреблением:
  • к 1 или 4 г параформальдегида добавить 80 мл дистиллированной воды и 7 (или 20) мкл 5 N NaOH, растворить при +50-60 °С при покачивании;
  • добавить к раствору 10 мл 10xPBS и 1 мл 5 М раствора MgCl2 (конечная концентрация 50 mM);
  • охладить раствор до комнатной температуры;
  • при необходимости довести pH до 7,0 концентрированной HCl (4-10 мкл);
  • довести объем раствора до 100 мл дистиллированной водой.
  1. Раствор для денатурации — 70 %-й деионизированный фор- мамид*, 2xSSC, рН 7,0 (70 мл деионизированного формамида; 10 мл 20xSSC, рН 7,0; H2O до 100 мл).

* Деионизация формамида: к 100 мл формамида добавить 10 г ионообменной смолы AG 501-X8, ячейка 20-50 (Bio-Rad), и перемешивать смесь на магнитной мешалке в течение нескольких часов. Затем несколько раз профильтровать смесь через фильтровальную бумагу ватман № 1. Профильтрованный формамид рекомендуется хранить в плотно закрытой стеклянной или пластиковой посуде.
Протокол 5.8
  1. Выдержать препараты 1 час при +60 °С.
  2. Дегидратировать препараты в серии спиртов (70°, 80°, 96° этанол) по 5 мин в каждом.
  3. Высушить препараты на воздухе.
  4. Нанести на препараты по 100 мкл рабочего раствора РНКазы А, накрыть покровными стеклами 22x50 мм. Обработку препаратов проводить во влажной камере в термостате при +37 °С в течение 1 часа. Если в качестве ДНК-зондов будут использоваться последовательности рДНК или другие последовательности, уровень экспрессии которых в исследуемой ткани высок, рекомендуется увеличить продолжительность этапа до 2-3 часов.
  5. Отмыть препараты при комнатной температуре в трех сменах 2xSSC и затем при +37 °С в 1 смене 1xPBS, по 5 мин в каждой смене, при покачивании.
  6. Обработать препараты в стакане с рабочим раствором пепсина при +37 °С в течение 10 мин. Препараты клеток с плотной оболочкой (амниоциты, буккальный эпителий, сперматозоиды и др.) обрабатывать 40-50 мин. Мазки крови обрабатывать не больше 1-2 мин или совсем исключить обработку.
  7. Отмыть препараты в растворе 1 x PBS в течение 5 мин при комнатной температуре, при покачивании.
  8. Фиксировать материал, поместив препараты в стакан с 1 %-м раствором параформальдегида на 10-15 мин. Для препаратов мазков крови или гистологических срезов использовать 4%-й раствор параформальдегида.
  9. Отмыть препараты в течение 5 мин в растворе 1xPBS при комнатной температуре, при покачивании.
  10. Дегидратировать препараты в серии спиртов (70°, 80°, 96° этанол) по 5 мин в каждом.
  11. Высушить препараты на воздухе.
  12. Денатурировать ДНК хромосом при +70-72 °С 2 мин, поместив препараты в стакан (кювету) с раствором для денатурации. Для клеток с плотной оболочкой продолжительность обработки и температуру увеличить — например, для клеток буккального эпителия оптимально — 25 мин. при +76-80 °С.
  13. Быстро перенести препараты в охлажденный до -20 °С 70%-й раствор этанола на 2 мин.
  14. Дегидратировать препараты в серии охлажденных до -20 °С спиртов (70°, 80°, 96° этанол) по 5 мин в каждом.
  15. Высушить препараты на воздухе.
  16. Обработанные препараты сразу использовать для гибридизации или в течение нескольких дней хранить при +4 °С в коробке с осушителем. Примечание

Все процедуры отмывок препаратов рекомендуется проводить в стаканах или кюветах для проводок на водяной бане-качалке. 

Источник: Баранов В.С., Кузнецова Т. В., «Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научно-практические аспекты» 2007

А так же в разделе «  Предгибридизационная обработка препаратов »