Клеточная стенка бактерий может быть удалена без существенных изменений метаболизма. Такие «голые» клетки в зависимости от степени удаления стенки получили название протопластов, или сферопластов. Протопласты представляют собой сферической формы структуры, у которых стенка удалена полностью. Сферопласты также имеют сферическую форму, но отличаются тем, что стенка у них частично сохраняется.
Протопласты обычно образуются из грамположительных бактерий, сферопласты - из грамотрицательных. Но не исключена возможность получения протопластов и из грамотрицательных бактерий. Для этого необходимо предварительное разрушение наружной мембраны, что может быть достигнуто обработкой бактерий ЭДТА (этилендиаминтетроацетат), или другими агентами, растворяющими липополисахариды мембраны.
Различная степень удаления клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных бактерий в одних и тех же условиях является следствием различного химического состава и структурной организации их клеточных стенок.
Общим свойством протопластов и сферопластов является чрезвычайная чувствительность к осмотическому давлению среды. Они могут существовать только в гипертонических и изотонических растворах (0,1-1,0 М раствор сахарозы или хлористого натрия), в гипотонических растворах они подвергаются лизису.
В основе получения протопластов и сферопластов лежит воздействие на клеточную стенку веществами, блокирующими ее синтез или разрушающими пептидогликан (ригидный слой). К первым относятся антибиотики пенициллин, бацитрацин, ванкомицин, которые подавляют синтез пептидогликана; ко вторым - ферменты лизоцим, мутанолизин, лизостафин, оказывающие специфическое действие на гликозидные и пептидные связи пептидогликана.
Протопласты и сферопласты обладают способностью к реверсии в исходные бактериальные формы. Уровень зависит от физиологического состояния протопластирующих клеток. Наиболее эффективно ревертируют протопласты, полученные из бактерий, находящихся в ранней экспоненциальной фазе роста. Положительное влияние на реверсию протопластов оказывают добавление в регенерационную среду дрожжевого экстракта, сыворотки, аминокислот, входящих в состав клеточной стенки, а также замена агара желатиной в твердой среде.
Наблюдения в электронный микроскоп за реверсией протопластов Вас, licheniformis показало, что вначале происходит увеличение их размеров, затем следует образование рыхлой, потом более плотной клеточной стенки. Одновременно формируются поперечные связи в пептидогликане, что придает ригидность клеточной стенке. Ревертировавшие протопласты способны к делению.
Протопласты и сферопласты используются для изучения структуры и функций клеточных мембран, биохимических особенностей микроорганизмов, а также для изучения генетических свойств бактерий. Применение протопластов в генетических исследованиях основано на их способности к слиянию и рекомбинационному взаимодействию между геномами.
Процесс слияния протопластов с целью получения рекомбинантного потомства выгодно отличается по ряду особенностей от других способов генетического обмена: 1) отсутствие барьера нескрещиваемости; 2) возможность взаимодействия полных родительских геномов и цитоплазм; 3) двунаправленный перенос генетической информации, т. е. оба родителя в равной мере могут служить донорами генетического материала. При слиянии протопластов взаимодействуют не отдельные фрагменты хромосом донорной и реципиентной клеток, как это имеет место при трансформации, конъюгации и трансдукции, полные геномы обоих родительских клеток. В формировании рекомбинантного потомства роль их одинакова. Образующиеся в результате слияния протопластов рекомбинанты характеризуются значительным разнообразием и могут быть использованы для генетического анализа. В протопластах способны репродуцироваться фаги. Однако, это возможно лишь в тех случаях, когда бактерии инфицированы фагом до разрушения клеточной стенки, т. е. превращения в протопласты. В подходящей среде, в изо- или гипертонических растворах, протопласты и сферопласты проявляют метаболическую активность, могут увеличиваться в размерах, но утрачивают способность к размножению.
Протопласты разных видов бактерий - грамотрицательны и неподвижны несмотря на наличие жгутиков.
Тождественны протопластам природные L-формы бактерий, которые в силу разных причин утратили способность к синтезу пептидогликана и также не имеют клеточной стенки. Они имеют форму сферических и вакуолизированных тел от «гигантских» (2-8 мкм) до ультра микроскопических (0,25 мкм) размеров. Отсутствие ригидной клеточной стенки позволяет им вытягиваться в тонкие нити, проходящие через бактериальные фильтры.
L-формы открыты в 1935 г. сотрудницей Листеровского института (Лондон) Е. Клинебергер-Нобель и в честь института получили свое название. Впервые они обнаружены в культуре бациллы Streptobacillus moniliformis, выделенной из уха крысы. Позже были описаны L-формы самых разнообразных видов бактерий: кишечной и дизентерийной палочки, протея, стрептококков, азотобактера, актиномицетов и др. Эти формы возникают спонтанно и индуцированно под действием агентов, блокирующих синтез клеточной стенки. Такими агентами могут служить антибиотики, ферменты, химические вещества (хлористый литий, теллурит натрия). Например, добавление в среду пенициллина (100- 200 ед/мл) препятствует синтезу клеточной стенки в растущих культурах протея, кишечной палочки. При удалении пенициллина или перенесении клеток на среду без него синтез клеточной стенки возобновляется. Однако встречаются и стабильные L-формы, не обладающие способностью к реверсии. В клетках некоторых стабильных L-форм компоненты пептидогликана полностью отсутствуют, у лабильных содержится мурамовая кислота, но в относительно низкой концентрации (10-15 % от содержания в нормальных клетках). Образование стабильных L-форм, возможно, имеет мутационную природу.
L-формы способны расти на плотных питательных средах и в культуре тканей. По характеру колоний и некоторым другим свойствам их разделяют на два типа: ЗА и ЗВ. Тип ЗА на агар изованных средах образует очень мелкие располагающиеся под поверхностью агара колонии, состоящие из гранул. Иногда такая колония прорастает на поверхность. Этот тип довольно стабилен и с трудом возвращается к исходной форме. Тип ЗВ образует на поверхности агара четко очерченные приподнятые колонии с темным ячеистым или зернистым центром, уплотненным вследствие роста колонии в толщу агара, L-формы типа ЗВ нестабильны. Они легко возвращаются к исходной форме бактерий.
Для роста этих организмов пригодны те же среды, что и для роста исходных бактерий. Однако стабильные L-формы лучше развиваются на средах, богатых питательными веществами и обладающих высокими осмотическими свойствами.