Лейкоциты по своей структуре и функциональным свойствам являются сложными ядерными клетками. Срок их жизни в кровяном русле точно не установлен; in vitro они являются очень лабильными, хрупкими, что, по- видимому, связано с наличием в них специфических гранул, изолированных от цитоплазмы, легко повреждаемой однослойной мембраной.
Основная функция полиморфноядерных лейкоцитов — фагоцитоз микробов, т.е. они являются клеточными факторами защиты организма.
Базофилы и эозинофилы обладают также тромболитической активностью. Лимфоциты играют большую роль как иммунологические компетентные клетки, содержащие значительное число антигенов.
Гранулоциты склонны к адгезии и агрегации, что представляет определенные трудности для их выделения из цельной крови и консервирования.
Лейкоконцентрат (КЛ) — трансфузионная среда с содержанием лейкоцитов в 4~8 раз больше, чем в периферической крови, с примесью эритроцитов, тромбоцитов и плазмы. КЛ может быть получен из свежезаготовленной консервированной крови донора несколькими способами:

1. Методом центрифугирования цельной крови с последующим удалением плазмы, выделением лейкотромбоцитарного слоя и его разделением на лейкоциты и тромбоциты повторным центрифугированием. В концентрате содержится до 70% лейкоцитов от их исходного содержания в крови (см. рис.2). Для получения лечебной дозы сливают несколько доз КЛ.
2. Методом ускоренного осаждения эритроцитов с применением коллоидных веществ и выделением плазмы, обогащенной лейкоцитами, для ее последующего центрифугирования и получения КЛ (в ней 70% лейкоцитов от исходного содержания).
3. Методом концентрирования лейкоцитов путем их вымывания из лейкоцитарных пленок многих доз консервированной крови. Полученный КЛ содержит до 85% лейкоцитов от исходного.
4. Методом фильтрационного лейкафереза — гепаринизированную кровь пропускают через специальные (нейлон, дакрон, шерсть) фильтры, которые задерживают лейкоциты. Последние элюируются с адсорбента растворами, содержащими хелатные агенты. Метод позволяет получить до 89% лейкоцитов от исходного содержания.
5. Метод лейкафереза с повторным использованием отдельных доз крови, полученной от одного и того же донора, и выделением из нее лейкотромбоцитарного слоя и из него КЛ, как указано в первом методе.
6. Методом лейкафереза с использованием автоматических сепараторов непрерывного действия типа Aminco, IBM, Haemonetics и др.

Наиболее оптимальным и перспективным оказался последний метод, который получил большое распространение. Лейкаферез на автоматических сепараторах непрерывного действия позволяет получить от одного донора за одну процедуру продолжительностью от 2 до 4 ч КЛ с большим числом (2—6х 1011) клеток.
В процессе сепарации донору возвращаются эритроциты, тромбоциты, плазма.
Полученный лейкоконцентрат не подлежит хранению, поэтому он должен использоваться для трансфузии в ближайшие часы после заготовки.
Большие перспективы для создания запасов и длительного хранения открывает метод криоконсервирования лейкоцитов.
В качестве основных компонентов ограждающих растворов применяют одно из следующих криофилактических веществ: ДМСО, ДМАЦ, глицерин, ПВП, ПЭО. Все они прочно связывают воду и предохраняют ее тем самым от полного, губительного для клетки, замерзания. Три первых из указанных веществ действуют интрацеллюлярно: связывают воду не только вне, но и внутри клетки и предотвращают концентрирование солей в результате вымораживания воды. Экстрацеллюлярно действуют ПВП и ПЭО: обволакивают клетку защитным слоем и связывают воду.
оттаивания и разведения раствором сохраняют жизнеспособность (по супра- витальной окраске эозином) около 85% клеток, при замораживании с глицерином — около 70%, а с ПВП — около 80% лейкоцитов.

Эти ограждающие растворы обеспечивают хорошую сохранность (почти на 100%) лимфоцитов, но процент жизнеспособных гранулоцитов при этом методе не превышает 70 даже с одним из наиболее распространенных крио- протекгоров (ДМСО). Между тем именно трансфузии гранулоцитов имеют основное лечебное значение в борьбе с септическими осложнениями у больных с лейкопенией и ослабленной фагоцитарной активностью лейкоцитов.
В нашей лаборатории разработан эффективный ограждающий раствор, в состав которого входит в качестве криопротектора эндоцеллюлярно действующий криофилакгик диметилацетамид (ДМАЦ). Среда, в которой взвешены лейкоциты, содержит 5% раствор ДМАЦ и 5% раствор глюкозы.
Данный раствор обладает наиболее высокими криозащитными свойствами при замораживании гранулоцитов, сохраняющий 84% резистентных к красителю клеток (ДМСО сохраняет 78% гранулоцитов, а глицерин — 49%). КЛ, замороженные с ДМАЦ, имеют также ряд других преимуществ: повышенная фагоцитарная активность гранулоцитов, отсутствие у больного при трансфузии неприятного запаха, свойственного ДМСО, малые концентрации препарата, не требующие его удаления из оттаянных лейкоцитов, и др. Это ставит ограждающий раствор с ДМАЦ для замораживания лейкоцитов на одно из первых мест.
Перед замораживанием ограждающий раствор переводят в сосуд с лейкоцитарной массой в равном объеме. Затем смесь клеток с раствором переводят в контейнеры, которые тщательно герметизируют. Лейкоциты — ядросодержащие клетки, не переносящие быстрого охлаждения, поэтому их подвергают медленному замораживанию по специальной программе в аппарате программного охлаждения, работающего на основе жидкого азота. Охлаждение осуществляют постепенно по двухступенчатой программе: температура на первом этапе до -13, -15, -18 °С снижается медленно (от 1 до 3 градусов в минуту), а затем сравнительно быстро до -196 °С (по 10 градусов в минуту). Возможно охлаждение и по одноступенчатой программе — по 3 градуса в минуту в течение всего цикла замораживания (до -196 °С).
По окончании замораживания контейнеры с лейкоцитной массой сразу переносят в бункер для хранения биопрепаратов, наполненный жидким
азотом. Это обеспечивает длительное, в течение 3—5 лет, сохранение клеток жизнеспособными. Хранение при более высокой температуре, например при -79 °С (температура сухой углекислоты), не гарантирует длительной сохранности клеток.
По мере надобности контейнеры с лейкоцитной массой переносят из хранилища в водяную баню с температурой 40 °С и оттаивают при осторожном помешивании. Такое быстрое отогревание очень важно, так как предохраняет клетки от повреждения рекристаллизацией. Недопустимо постепенное согревание контейнера после его изъятия из хранилища с азотом.
Не следует допускать как неполного оттаивания, так и нагревания контейнера выше комнатной температуры. Время согревания устанавливают в зависимости от объема смеси и состава ограждающего раствора.
Размороженные КЛ не подлежат хранению (опасность образования агрегатов) и должны быть перелиты больному без промедления и не позднее 30 мин.
Метод криоконсервирования позволяет создать банк лейкозных клеток, предназначенных для исследовательских целей и иммунотерапии больных лейкозом.
В этом случае из крови больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) легко удается получить огромное количество лейкоцитов (за одну процедуру на сепараторе типа «Аминко» — 6x10й и более клеток).
В исключительных случаях лейкаферезу могут подвергаться больные ХМЛ, имеющие уровень лейкоцитов более 1000* Ю9/л.
Несмотря на отличия зрелых нейтрофильных гранулоцитов больного ХМЛ от здоровых клеток, в том числе и сниженной бактерицидной и фагоцитарной активности, имеется достаточно доказательств лечебной эффективности их трансфузий. При этом следует иметь в виду, что отбор реципиентов для трансфузий миелолейкозных лейкоцитов строго ограничивается специальным кругом онко-гематологических больных из-за теоретически существующей возможности инокуляции лейкоза, хотя такие осложнения не опубликованы.
Совместно с С.В. Ермоловичем (1982, 1983) были проведены специальные исследования метода криоконсервирования миелолейкозных лейкоцитов с ДМАЦ. КЛ замораживали до температуры -196 °С и хранили в жидком азоте (сроки хранения от 168 до 1496 дней). Таким образом, был создан банк замороженных КЛ. За 5-летний период в него было заложено 832 специальных контейнера с концентратами клеток емкостью от 50 до 160 мл. Трансфузии КЛ использовали в гематологической клинике (зав. — проф. Ф.Э. Файн- штейн) у больных с гемобластозами в комплексной терапии инфекционных осложнений.
Было изучено влияние криоконсервирования с ДМАЦ на морфологические и физиологические свойства лейкоцитов. Сравнивали их абсолютное число до и после замораживания, так как, согласно накопленному опыту, при применении известных криопротекгоров часть лейкоцитов полностью лизируется в процессе замораживания-оттаивания. При консервировании с ДМАЦ абсолютная убыль клеток при различных их концентрациях была весьма невелика (колебалась от 2,5 до 2,9%).
Для определения количества жизнеспособных клеток обычно использовалась проба Шрека, заключающаяся в окрашивании нативного препарата раствором эозина. Жизнеспособность лейкоцитов до замораживания составляла по эозину 98—100%. Жизнеспособность оттаянных лейкоцитов через 5 мин составляла в среднем 83,9±1,79%, через 30 мин — 76,0±1,75%, через 60 мин — 65,83±1,76%. Агглютинация (к агглютининам относили единичные плотные скопления прокрашенных эозином клеток числом обычно от 5 до 20) в те же сроки наблюдалась соответственно в 9,6%; 32,2%; 61,2% препаратов. Следовательно, тенденция к образованию микроагтлютинатов опережала падение жизнеспособности лейкоцитов.
Имитируя переливания оттаянного КЛ реципиенту, мы соединяли его с плазмой АВ /IV/ группы, нагретой до 37 °С, в соотношении 1:1. Жизнеспособность и агглютинация клеток оценивалась в те же промежутки времени. Оказалось, что оттаянные клетки достаточно устойчивы к создаваемым осмотическим нагрузкам (жизнеспособность клеток в этих условиях уменьшилась на 7,75—10,84%). Однако в этих условиях количество агтлютинатов лейкоцитов нарастало к исходу первого часа после оттаивания (обнаружены в 80,6% препаратов).
Добавление полиглюкина в экстракорпоральный круг системы сепаратора «Аминко» обеспечивало повышение жизнеспособности оттаянных клеток и уменьшение их агглютинации. Это, очевидно, связано с некоторым крио- защитным действием декстранов и их способностью уменьшать агглютинацию лейкоцитов. Аналогичные исследования в литературе нам не встречались.
Характерно, что при замораживании лейкоцитов с ДМАЦ величина их конечной концентрации практически не отражалась на жизнеспособности после оттаивания. Не получено также достоверных различий в количестве жизнеспособных клеток в зависимости от сроков хранения в замороженном состоянии (от 2 суток до 3 мес и от 12 до 37 мес).
При изучении морфологии лейкоцитов, окрашенных по Романовскому- Гимза, оказалось, что после оттаивания они несколько уменьшились в объеме, нарастала базофилия цитоплазмы и уплотнение ядерного хроматина гра- нулоцитов (ГРЦ). Процент разрушенных (частично или полностью) клеток колебался через 5 мин после оттаивания от 3 до 18, что близко к результатам суправитального окрашивания. Разрушенные клетки относились к гра- нулоцитарному ряду, однако, нам не удалось прийти к однозначному заключению о большей или меньшей чувствительности ГРЦ, различающихся по степени зрелости, к действию ультранизких температур.
Следовательно, при замораживании КЛ с ДМАЦ количество структурно поврежденных клеток (в том числе зрелых) невелико.
Однако только функциональная полноценность оттаянных клеток могла служить надежным признаком эффективности крио консервирования. Изучены поглотительная активность, фагоцитарный индекс, переваривающая способность оттаянных зрелых ГРЦ, а также содержание в них внутриклеточных лизосома и лактоферрина. Клетки, полученные путем седиментацион- ного лейкафереза, после оттаивания сохраняли 48—72% исходной фагоцитарной активности. Переваривающая способность была близка к исходной.
Очевидно, «мягкая» процедура седиментационного лейкафереза обеспечивала наименьшее повреждение и удовлетворительные функциональные свойства ГРЦ после оттаивания. Оказалось, что если до замораживания КЛ добавление полиглюкина в экстракорпоральную систему сепаратора не оказывало существенного влияния на показатели фагоцитоза ГРЦ, то после размораживания их различия становились статистически достоверными, причем клетки оказывались функционально более полноценными (с полиглюкином они сохраняли 43,4% исходной фагоцитарной активности, без него — 24,82%). Таким образом, введение полиглюкина улучшало качественные характеристики оттаянных клеток. Фагоцитарная активность оттаянных клеток, хранившихся при температуре -196 °С от 5 суток до 3 мес и более года (17 мес) была практически одинаковой. Содержание внутриклеточных лизоцима и лактоферрина до и после замораживания были близки и могли служить признаком достаточной функциональной сохранности ГРЦ, криконсервиро- ванных с ДМАЦ.
При определении времени циркуляции оттаянных лейкоцитов больных ХМЛ, меченных хромом-51, были исследованы образцы аутологичных КЛ. Сроки циркуляции лейкоцитов колебались в пределах 1—3 суток, что подтверждает целесообразность частых, желательно ежедневных, трансфузий КЛ. Изучение способности клеток-предшественников гранулоцитопоэза к коло- ниеобразованию в агаровых структурах показало, что они хорошо переносили криоконсервирование с ДМАЦ. После оттаивания КОЕ снижалось на 24,5%, а КлОК — на 20,4% по отношению к первоначальному уровню, что свидетельствует о высокой криорезистентности клеток-предшественников гранулопоэза и, в частности, является важной предпосылкой использования богатой ими КЛ в комплексной терапии больных с бластным кризом. При изучении (метод Эшби) возможности репопуляции перелитых клеток в организме реципиента оказалось, что они функционировали до 21 дня.
Однако главным критерием оценки ДМАЦ как криозащитного вещества для замораживания КЛ являются полученные нами результаты их клинического применения (см. соответствующий раздел). Совокупность накопленных данных свидетельствует об удовлетворительной морфофункциональной сохранности оттаянных зрелых ГРЦ, сохранении их способности к циркуляции в организме реципиента, гемопоэтических возможностях криокон- сервированных родоначальных клеток, что обосновывает целесообразность применения этой трансфузионной среды в системе лечения инфекционных осложнений у больных гемобластозами.