Техника иммуноцитохимического окрашивания метафазных пластинок с использованием моноклональных антител к 5-метилцитозину подробно изложена в Приложении. Отметим только, что одним из ключевых этапов в процессе связывания АТ-МеС с участками, содержащими метилированный цитозин, является денатурация хромосомной ДНК. При апробировании двух наиболее распространенных способов денатурации — УФ-облучение и воздействие 2М HCl — в качестве оптимальной была избрана кислотная обработка в течение 25-30 мин, так как она обеспечивала наиболее полную денатурацию хромосом, не изменяя их морфологические характеристики.
Распределение флуоресцентных сигналов по длине хромосом ока*
залось неравномерным по длине хромосом (рис. 10.22) и стабильно воспроизводилось во всех проанализированных 72 метафазных пластинках из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови
от 7 доноров с нормальным кариотипом. При сравнении М-сегмента-
*
ции и QFH/AcD-исчерченности (рис. 10.23) установлено, что большинство сайтов связывания АТ-МеС соответствуют R- и Т-сегментам. Высокая плотность сайтов связывания антител отмечена также в районах прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 3, 9, 16 и в коротких плечах акроцентрических хромосом групп D и G.
На основе распределения по длине хромосом флуоресцентных сигналов АТ-МеС, имеющих различную интенсивность, визуально оце-
*
ненную в баллах, были составлены идиограммы (рис. 10.24) . Интенсивный сигнал (4 балла) был выявлен в большинстве Т- и в некоторых R-сегментах, в прицентромерном гетерохроматине хромосом 1, 16 и в коротких плечах больших и малых акроцентриков. Средняя (3 балла) и слабая (2 балла) флуоресценция была характерна для большинства R-, некоторых Т-сегментов и для прицентромерного гетерохроматина хромосом 3 и 9. В семнадцати R-сегментах на хромосомах 2, 3, 4, 6, 8, 9, 13, 16 и во всех G-сегментах флуоресцентный сигнал был очень слабым (1 балл), а в центромерных участках отсутствовал (0 баллов) (рис. 10.23, 10.24)*.
Типичная локализация и различия в интенсивности флуоресценции позволили идентифицировать легко узнаваемые маркеры (landmarks) для каждой пары аутосом. В качестве таких М-маркеров были определены районы с интенсивностью флуоресценции 3 и 4 балла. Исключение составил только участок 15q24, флуоресценция которого не превысила 2 балла. Большинство М-маркеров совпадали с Т-сегмен- тами, некоторые — с отдельными R- и C-сегментами. Основные характеристики участков аутосом, выделенных в качестве постоянных морфологических маркеров М-сегментации хромосом в лимфоцитах, приведены в таблице 10.4. Специфика М-сегментации половых X- и Y-хромосом не рассматривалась в рамках проведенного исследова-
Таблица 10.4. Характерные морфологические маркеры, выявляемые на метафазных хромосомах человека с помощью специфических моноклональных антител к 5-метилцитозину

Хромо сома	Плечо, сегмент	Расположение морфологического маркера	Интенсивность флуоресценции, баллы
	р36	Дистальный Т-сегмент	4
i	q12, q21	Район, объединяющий прицентромерный гетерохроматин и смежный с ним Т-сегмент	4
	q42	Дистальный R-сегмент	4
	р25	Дистальный R-сегмент	3
2	p23	Дистальный R-сегмент	3
	q37	Дистальный Т-сегмент	4
	р25	Дистальный Т-сегмент	4
	p21	Медиальный Т-сегмент	4
3	q21	Проксимальный Т-сегмент	4
	q27	Дистальный R-сегмент	4
	q29	Дистальный R-сегмент	4
4	р16	Дистальный Т-сегмент	4
	q35	Дистальный R-сегмент	4
	р15	Дистальный Т-сегмент	4
5	q31	Дистальный R- и Т-сегмент	3
	q35	Дистальный R- и Т-сегмент	4
	р23	Дистальный R-сегмент	3
6	p21	Медиальный Т-сегмент	3
	q25	Дистальный R-сегмент	4
	q27	Дистальный R-сегмент	4
	р22	Дистальный Т-сегмент	4
7	q11.2	Проксимальный Т-сегмент	4
	q22	Медиальный Т-сегмент	4
	q36	Дистальный Т-сегмент	4

Таблица 10.4 (продолжение)

Хромо-	Плечо,	Расположение морфологического маркера	Интенсивность флуоресценции,
			баллы
	р23	Дистальный R-сегмент	4
8	p21	Медиальный Т-сегмент	4
	q24	Дистальный Т-сегмент	4
9	р12	Район прицентромерного гетерохроматина	3
	q34	Дистальный Т-сегмент	4
	р15	Дистальный R-сегмент	4
10	p13	Медиальный Т-сегмент	4
	q11.2	Проксимальный R-сегмент	3
	q26	Дистальный Т-сегмент	4
	р15	Дистальный Т-сегмент	4
11	q13	Проксимальный Т-сегмент	4
	q23	Дистальный Т-сегмент	4
12	р13	Дистальный R-сегмент	4
	q24	Дистальный Т-сегмент	4
	q12	Проксимальный R-сегмент	3
13	q32	Дистальный R-сегмент	4
	q34	Дистальный R-сегмент	4
14	q24	Дистальный R- и Т-сегмент	3
	q32	Дистальный R- и Т-сегмент	4
	р11.2	Прицентромерный гетерохроматин	4
15	q24,	Дистальный R-сегмент	2
	q26	Дистальный R-сегмент	3
	р13	Дистальный Т-сегмент	4
16	q11.2	Проксимальный R-сегмент	3
	q24	Дистальный Т-сегмент	4

Таблица 10.4 (окончание)

Хромо сома	Плечо, сегмент	Расположение морфологического маркера	Интенсивность флуоресценции, баллы
17	р13	Дистальный Т-сегмент	4
	q21 q25	Медиальный Т-сегмент Дистальный Т-сегмент	3 4
18	р11.2	Проксимальный R-сегмент	3
	q23	Дистальный R-сегмент	4
19	р13	Т-сегмент	4
	q13	Т-сегмент	4
20	р13	Дистальный R-сегмент	3
	q11.2 q13	Проксимальный Т-сегмент Дистальный Т-сегмент	4 4
21	р11.2	Район прицентромерного гетерохроматина	4
	q22	Дистальный Т-сегмент	4
22	р11.2	Район прицентромерного гетерохроматина	4
	q11.2 q13	Проксимальный Т-сегменты	4 4

ния. Учитывая случайную инактивацию Х-хромосомы в соматических клетках, содержащих две и более Х-хромосомы, особенности их метилирования являются предметом специального изучения.
Как и в случае ник-трансляции in situ, опосредованной чувствительными к метилированию рестриктазами, М-сегменты, выявляемые на метафазных хромосомах с помощью специфических антител, характеризуются выраженными различиями в интенсивности флуоресценции. Последние могут быть обусловлены степенью спирализации хромосом, доступностью сайта-мишени для специфических антител, а также плотностью 5-метилцитозина в соответствующих участках.
Фактор спирализации был минимизирован путем отбора метафазных пластинок со средней степенью спирализации хромосом, соответствующей разрешению ~ 400 сегментов на гаплоидный геном. Условия экспериментов были подобраны таким образом, что хромосомы набора были в равной степени денатурированы по всей длине, что обеспечивало одинаковый доступ антител к сайтам связывания. Таким образом, различия интенсивности флуоресценции в условиях применения специфических антител в наших исследованиях, главным образом, определялись степенью метилирования CpG-динуклеотидов хромосомных сегментов.
Напомним, что R-сегменты имеют ярко выраженную неоднородность нуклеотидного состава и подразделяются на относительно GC-бедные (L1 и L2) и GC-богатые районы (Н1, Н2 и Н3) [229, 772]. Н3+-районы наиболее обогащены GC-динуклеотидами и соответствуют всем Т- и отдельным R-сегментам [772]. Интенсивность флуоресценции АТ-МеС в Н3+-участках варьирует от 2 до 4 баллов, что свидетельствует о различной степени их метилирования (рис. 10.24). При этом большинство сегментов характеризуется интенсивной флуоресценцией (4 балла), в то время как в отдельных Н3+-сегментах она не превышает 3 баллов. Более того, единичные R-сегменты хромосом 9 и 15, соответствующие Н3+-участкам (9р13, 9q22, 9q32, 15q15, 15q24), характеризуются слабым флуоресцентным сигналом (2 балла).
Как уже упоминалось, метилированный цитозин, в основном, в виде динуклеотидов CpG, находится в CpG-островках, распределенных в геноме человека неравномерно [326, 869]. В R-сегментах локализовано 80 % СpG-островков, расстояние между которыми составляет менее 100 т.п.н., в то время как в G-сегментах расстояние между этими островками превышает 1000 т. п. н. [229, 336]. Согласно нашим наблюдениям, сегменты хромосом, обогащенные СpG-островками, имеют высокий уровень метилирования. Вместе с тем, некоторые сегменты хромосом 6, 9, 10, 13, 15, характеризующиеся высокой плотностью СpG-островков [229], обнаруживают слабый (2 балла — 9p13, 9q22, 10q24, 13q22, 15q24) или даже очень слабый флуоресцентный сигнал (1 балл — 6q15, 6q21, 6q23, 13q22).
Примечательно, что два сегмента хромосомы 9 (9p13, 9q22) и один хромосомы 15 (15q24), характеризующиеся высоким содержанием изохора Н3+ и СpG-островков, имели низкий уровень флуоресценции
(рис. 10.24) , что, по всей вероятности, свидетельствовало об их гипометилированном состоянии. Известно, что GC-обогащенность коррелирует с плотностью генов. Последняя может достигать 20-кратной разницы при сравнении разных R-сегментов метафазных хромосом [252, 253, 837, 842, 907]. Можно предполагать, что слабая степень метилирования некоторых участков хромосом, богатых CG-динуклеотидами и характеризующихся наибольшей плотностью генов, свидетельствует об их функциональной активности в исследуемом типе клеток на соответствующей стадии развития. Интересно отметить, что большинство Т-сегментов хромосом в клетках цитотрофобласта, которые на основании результатов ник-трансляции, опосредованной HpaII и ДНКазой!, были причислены к гипометилированным, оказались ги- перметилированными в лимфоцитах периферической крови. Исключение составили сегменты 7q32 и 9q22, которые характеризовались гипометилированным состоянием в обоих типах клеток.
Хромосом-специфичный уровень метилирования был отмечен также для блоков прицентромерного гетерохроматина. Интенсивность флуоресценции гетерохроматина хромосом 1 и 16 на всех проанализированных метафазах была высокой (4 балла) и не зависела от размеров блока. Вместе с тем, для района 9q12 был характерен сигнал меньшей интенсивности (3 балла). Известно, что в геноме человека гетерохроматин большей частью образован сателлитной ДНК I, II, III классов, распределение которых характеризуется определенной хро- мосом-специфичностью [229, 485]. В состав гетерохроматина хромосомы 9 преимущественно входят сателлиты III и р, более обогащенные CG-динуклеотидами, по сравнению с сатДНК прицентромерных гетерохроматиновых районов хромосом 1 и 16. Не исключено, что гипометилированное состояние гетерохроматина хромосомы 9 важно для поддержания особой конформационной структуры этого района, необходимой для сохранения функциональной активности.
Отличия в интенсивности флуоресценции АТ-МеС наблюдались в коротких плечах акроцентрических хромосом. Как уже обсуждалось выше, причиной этих различий являются полиморфизм сателлитных последовательностей ДНК, входящих в состав прицентромерного гетерохроматина и спутников, и различная активность локализованных в спутничных нитях рибосомных генов.
Таким образом, цитохимический анализ метафазных хромосом человека с использованием специфических антител к 5-мегилцигозину позволил обнаружить новый вариант дифференциальной исчерченности, который можно рассматривать как М-сегментацию. В какой мере рисунок М-метилирования хромосом культивированных лимфоцитов характерен для клеток других тканей, зависит ли он от функциональной организации хромосом, изменяется ли он в эмбриогенезе и в процессе клеточной диф- ференцировки рассмотрено в следующем разделе.