Разнообразная этиология, отсутствие специфических симптомов и однотипность клинических проявлений ВУИ обосновывают необходимость своевременного использования современных специальных лабораторных методов, направленных на достоверную верификацию этиологии ВУИ. Особенностью современной клинической медицины является внедрение высокоинформативных диагностических технологий в практику
здравоохранения.
Методы лабораторной диагностики ВУИ разделяют на две группы (в зависимости от способов идентификации возбудителя):
1) «прямые» - непосредственное выявление возбудителя заболевания, его генома или антигенов
К прямым методам идентификации возбудителя относятся
классические микробиологические (вирусологический, бактериологический, паразитологический), а также современные методы - молекулярно­биологические (ПЦР, ДНК-гибридизация - определение ДНК и РНК возбудителя), иммунофлюоресценция (РИФ) и иммунохроматографические методы (выявление вирусных или бактериальных антигенов в различных биологических средах)
2) «непрямые» - «серологические» - обнаружение в сыворотке крови маркеров специфического иммунного ответа на воздействие антигенов
К непрямым методам относятся ИФА (определение специфических антител к антигенам возбудителя - IgM, IgA, IgG), РНИФ, иммуноблот.
При наличии клинико-анамнестических данных, указывающих на вероятность ВУИ у новорожденного, верификацию заболевания необходимо проводить с использованием комплекса методов лабораторных исследований, включающего прямые и непрямые методы диагностики, которые позволяют:
- установить этиологию заболевания - идентификация самого возбудителя, его генома или антигенов;
- определить остроту и стадию инфекционного процесса (изучение активности репликации возбудителя, обнаружение серологических маркеров иммунного ответа - раздельное и количественное определение специфических антител классов IgM и IgG с их авидностью);
- оценить и дифференцировать латентное течение инфекции и активный инфекционный процесс.
Для комплексного лабораторного обследования необходимо:
- правильный выбор - методов исследования с количественным определением; материала для исследования; сроков обследования;
- обследование разными методами и в динамике;
- обследование в паре «мама-новорожденный»;
- грамотная интерпретация результатов исследований.
Получаемые результаты исследований различными методами
обусловлены:
- наличием ограничений для каждого метода,
- особенностями микроорганизма,
- наличием у пациента признаков ранее перенесенной или латентной инфекции,
- развитием синдрома иммуносупрессии,
- локализацией возбудителя в органах и тканях, недоступных для взятия биоматериала,
- неправильной техникой забора, нарушениями условий хранения и транспортировки биологического материала в лабораторию.
Трудности интерпретации результатов лабораторного обследования связаны со следующими причинами:
- неоднозначный ответ «незрелой» иммунной системы новорожденных;
- наличие смешанного (микст) внутриутробного инфицирования;
- высокая вероятность постнатального инфицирования после поступления детей в стационары на второй этап выхаживания (при гемотрансфузиях, при вскармливании инфицированным грудным молоком, контактным и воздушно-капельным путями).
С учетом возможной гипо- и гипердиагностики, ВУИ должна быть верифицирована не менее чем двумя методами. «Золотым стандартом» лабораторной диагностики ВУИ считается комбинация «прямых» и «непрямых» методов диагностики, что позволяет существенно повысить диагностические возможности лабораторной верификации этиологии ВУИ. Наиболее часто используются два основных метода - серологический (ИФА) и молекулярно-биологический (ПЦР).
Лабораторные критерии активности инфекционного процесса (верификации этиологии ВУИ):
1) маркеры активной репликации вирусов - вирусемия, ДНК-емия, АГ-емия (при поражении ЦНС - обнаружение вируса, его генома или АГ в ликворе);
2) серологические маркеры активной инфекции:
- выявление специфических анти-IgM, анти-IgA и/или низкоавидных анти-IgG, с нарастанием их титров в динамике (по степени авидности можно косвенно охарактеризовать период и остроту инфекционного процесса; авидность антител в течение иммунного процесса постепенно повышается; обнаружение высокоавидных антител позволяет исключить активную фазу заболевания);
- 4-х кратное и выше нарастание титров антител класса IgG в «парных сыворотках» (2 пробы через 14-21 день).
Обнаружение в крови специфических анти-IgM указывает на активнотекущий острый или хронический процесс, тогда как обнаружение анти-IgG больше свидетельствует о перенесенной инфекции или ее реактивации.
Российской ассоциацией специалистов перинатальной медицины (РАСП) в 2016 году разработан проект клинических рекомендаций по диагностике, лечению и профилактике врожденной инфекции, в котором определены критерии диагностики ВУИ.
1. Критерии диагностики врожденной цитомегаловирусной инфекции:
1) Диагноз «Врожденная острая ЦМВИ, манифестная форма» устанавливается новорожденному - при наличии клинических проявлений заболевания и этиологической верификации одним из следующих способов:
- обнаружение специфических IgM (выявленных дважды с интервалом между исследованиями 5-7 суток методами ИФА или ХЛИА - иммунохемилюминисцентный анализ);
- положительной ПЦР или выявлении антигенов ЦМВ методом ИЦХ (иммуноцитохимический анализ) в заведомо стерильных субстратах (кровь, ликвор);
- идентификации ЦМВ вирусологическим методом в заведомо стерильных образцах - БКМ;
- отсутствием снижения величины специфических IgG в сыворотке крови ребенка при их определении в возрасте 6 недель (в сравнении с исходным уровнем величина снижается менее, чем на 40%);
- сероконверсии (появлении и нарастании специфических IgM или IgG) при условии выполнения исследований в одной и той же лаборатории, одним и тем же методом.
Диагноз «Врожденная острая ЦМВИ, субклиническая форма» устанавливается ребенку первого года жизни - при отсутствии клинических проявлений заболевания в период новорожденности и этиологической верификации одним из способов, перечисленныхдля манифестной формы врожденной острой ЦМВИ.
Диагноз «Врожденная ЦМВИ» не может быть установлен на основании однократного выявления у ребенка первого года жизни специфических IgG любой авидности.
Врожденный характер заболевания может быть подтвержден путем выделения вируса из глоточного мазка или пробы мочи, взятых в течение первых 3 недель жизни новорожденного (на монослойных культурах фибробластов эмбриона человека или диплоидных культур клеток легких человека с последующим микроскопическим определением цитопатогенного действия вируса), либо путем выявления генетического материала ЦМВ (в ПЦР), его антигенов (в ИЦХ) в заведомо стерильных субстратах (оптимально - со 2-х по 7-е сутки жизни).
2) Необходимый минимум исследований для этиологической верификации заболевания при подозрении на врожденную ВПГ-инфекцию у новорожденных:
- исследование сыворотки крови (ликвора) новорожденного (и матери - сыворотка крови) одновременно количественно на IgM и IgG к ВПГ методом ИФА (или ХЛИА) с указанием пороговых значений чувствительности по данной тест-системе (для IgG - в МЕ/мл, для IgM - в условных единицах, в виде коэффициента позитивности или величин оптической плотности исследуемого образца и положительной контрольной сыворотки);
- исследование мазков-отпечатков с высыпаний на слизистых, коже, крови (лейкоконцентрата), ликвора на наличие генетического материала ВПГ методом ПЦР;
- исследование тех же биосубстратов на наличие антигенов ВПГ методами ИЦХ, ИГХ (иммуногистохимический анализ) с использованием моноклональных сывороток, в реакции иммунофлюоресценции.
Для этиологической верификации дополнительно могут использоваться (при возможности выполнения) определение авидности IgG в динамике (временное снижение с последующим нарастанием в первые 6 месяцев жизни).
2. Критерии диагностики врожденной ВПГ-инфекции:
Диагноз «Врожденная ВПГ-инфекция» устанавливается
новорожденному - при наличии клинических проявлений заболевания и этиологической верификации одним из следующих способов:
- наличии положительной ПЦР в мазках-отпечатках с элементов сыпи, в крови (лейкоконцентрате), ликворе или выявлении антигенов ВПГ методом ИЦХ в мазках-отпечатках, в заведомо стерильных субстратах (кровь, ликвор) в первые две недели жизни;
- обнаружение специфических IgM в количестве в 2 и более раз превышающем порог чувствительности реакции (выявленных дважды с интервалом между исследованиями 5-7 суток методами ИФА или ХЛИА);
- идентификации ВПГ вирусологическим методом в заведомо стерильных образцах в первые две недели жизни;
- отсутствием снижения величины специфических IgG в сыворотке крови ребенка при их определении в возрасте 6 недель (в сравнении с исходным уровнем величина снижается менее, чем на 40%);
- сероконверсии (появлении и нарастании специфических IgM или IgG) при условии выполнения исследований в одной и той же лаборатории, одним и тем же методом.
3. Критерии диагностики врожденного токсоплазмоза
Лабораторная диагностика включает:
- выделение возбудителя из крови, ликвора;
- обнаружение ДНК или антигенов возбудителя методом ПЦР;
- серологическое исследование сыворотки крови новорождненного и матери одновременно и в динамике через 2 недели количественно на IgM и IgG к токсоплазмам методом ИФА (или иммунохемилюминисцентным методом) с указанием пороговых значений чувствительности по данной тест­системе (для IgG - в МЕ/мл, для IgM - в условных единицах в виде коэффициента позитивности или величин оптической плотности исследуемого образца и положительной контрольной сыворотки);
При увеличении титра антител IgG у ребенка через 10-14 дней в 4 раза и более можно говорить об активном инфекционном процессе. Положительный IgM тест указывает на острую инфекцию, но выявляется не во всех случаях ВТ, а в некоторых требует подтверждения.
- Диагноз «Врожденный острый токсоплазмоз, манифестная форма» устанавливается новорожденному при наличии клинических проявлений заболевания, IgM в количестве в 2 и более раз превышающем порог чувствительности реакции (выявленных дважды с интервалом между исследованиями 5-7 суток), либо положительной ПЦР или выявлении антигенов токсоплазм методом иммуноцитохимии в заведомо стерильных субстратах (кровь, ликвор), или тахизоитов токсоплазм методом прямой микроскопии.
- При отсутствии специфических IgM, отрицательных результатах ПЦР, иммуноцитохимического исследования диагноз может быть верифицирован отсутствием снижения величины специфических IgG в сыворотке крови ребенка при их определении в возрасте 6 недель (в сравнении с исходным уровнем величина снижается менее, чем на 40%) или сероконверсии (появлении и нарастании специфических IgM) при условии выполнения исследования в одной и той же лаборатории, одним и тем же методом.
- Если у ребенка выявляются резидуальные явления врожденного токсоплазмоза, перенесенного внутриутробно (атрофия зрительных нервов, стабильная гидроцефалия, микрофтальм и др) диагноз формулируется как «Врожденный хронический токсоплазмоз, ремиссия (обострение), с резидуальными явлениями (какими)».
- Диагноз «Врожденный латентный токсоплазмоз» устанавливается в случаях, когда по результатам динамического наблюдения ребенка (к концу первого года жизни), у которого была документирована субклиническая форма врожденного острого токсоплазмоза, отсутствуют клинические признаки врожденного токсоплазмоза и резидуальные явления, специфические IgM, а ПЦР - отрицательна (величина и авидность IgG, результат ИЦХ не имеют значения).
- При выявлении признаков реактивации инфекции (новые очаги хориоретинита, субфебрилитет, персистирующий лимфаденит) устанавливается диагноз «Хронический токсоплазмоз, обострение».
- Диагноз «Врожденный токсоплазмоз» не может быть установлен на основании однократного выявления у ребенка первого года жизни специфических IgG любой авидности.