ДНК-вакцины
Новой потенциально полезной стратегией иммунизации явилось внутримышечное или внутрикожное введение плазмидной ДНК, кодирующей вирусные
протективные антигены. Открытые возможности использования ДНК в качестве вакцины явились наиболее революционным достижением стремительно развивающейся технологии рекомбинантной ДНК. Создание ДНК-вакцин стало возможным благодаря разработке вирусных векторных систем. Повышению эффективности доставки ДНК в клетки и установлению длительной экспрессии чужеродной ДНК в трансфицированных клетках организма.
Новое направление в иммунопрофилактике называют «генетической иммунизацией» или «иммунизацией нуклеиновыми кислотами» [1493, 1677].
Хотя способность ДНК и РНК вызывать синтез соответствующих белков после их проникновения в клетку известна давно, только недавно была осознана возможность данной технологии для создания специфического иммунитета. Новый принцип иммунизации состоит в том, что в организм вводят не вирусный антиген, а ДНК, кодирующую синтез этого антигена (белка). Оказалось, что вирусная ДНК сама по себе может быть использована как вакцина. Детальный анализ развития исследований в этом направлении показал, что такое не является сюрпризом. Было известно, что ДНК и РНК многих вирусов, инфицируя клетки, могут осуществлять полный цикл репликации.
В 1990 г. Вульф и сотр. [1677] обнаружили, что плазмидная конструкция ДНК, включающая ген галактозидазы, введенная в скелетную мышцу мыши, длительно (до 60 дней) экспрессирует фермент. Вскоре после этого было показано, что после ДНК-вакцинации у животных образуются специфические антитела [1493], развивается клеточный иммунитет и защита от вирусной инфекции [1558].
Экспрессия чужеродных генов in vivo может обходиться без сложных систем, используя прямое введение плазмидной ДНК. ДНК-экспрессируюшие векторы для этих целей могут быть реализованы несколькими путями. Простейшим и неожиданно одним из наиболее эффективных методов является введение ДНК в солевом растворе («голая» ДНК).
Введение плазмидной ДНК, содержащей репортерные гены, в солевом растворе вызывает экспрессию белков in vivo [1677].
ДНК-вакцины обычно содержит плазмиду E.coli с сильным промотором и репортерный ген. Плазмида амплифицируется обычно в E.coli, очищается, суспендируется в буферном растворе, а затем просто вводится в организм.
Рекомбинантные плазмиды представляют собой конструкции, содержащие гены, способные экспрессировать нужные вирусные антигены. Клетки организма, по крайней мере вначале, в месте инъекции трансформируются плазмидой, ДНК транспортируется к ядру, где транслируется интересующий (репортерный) белок. Экспрессия репортерных генов обнаружена в мышцах, селезенке, печени, коже, легких и мозге. Однако наиболее выраженная экспрессия обнаружена в мышцах. Ее можно было обнаружить в течение минуты после инъекции. Она максимально проявлялась через 1—2 недели, а затем постепенно снижалась, но могла быть обнаружена, по крайней мере, через 19 месяцев. Механизм интернализации ДНК клетками еще не выяснен и неизвестно, почему мышечные клет
ки являются наиболее эффективной клеточной мишенью трансфекции при прямом введении ДНК. Простое объяснение, состоящее в том, что ДНК просачивается в клетки в результате повреждения при введении, не подтверждено экспериментально. Скорее можно предположить, что в этом могут участвовать физиологические процессы включения ДНК. Так как внутримышечная иммунизация оказалась наиболее эффективной, вначале думали, что трансфицированные ми- оциты ответственны за поддержание продукции антигена и функционируют как антиген-презентирующие клетки. Сейчас считают, что для этого требуются «профессиональные» антиген-презентирующие клетки, происходящие из костного мозга, эти клетки инфильтрируют место присутствия антигена и играют роль местного лимфоузла. Также может иметь место прямая трансфекция анти- ген-презентирующнх клеток, особенно клеток лангерганса при внутрикожном введении [1130].
Иммунизация ДНК имеет некоторые преимущества перед иммунизацией очищенными вирусными антигенами. Наиболее важным преимуществом является то, что вирусные антигены, такие как вирусные гликопротеины, могут экспрессироваться на поверхности трансфецированных клеток и представляться иммунной системе в нативном виде. В процессе очистки вирусных белков, сборки и очистки ВПЧ или химической инактивации вирусов структура эпитопов на протективных белках может быть нарушена и вызовет ослабление иммуногенности. ДНК-иммунизация устраняет эти проблемы и больше напоминает иммунизацию живыми вирусными вакцинами, чем неживыми вирусными антигенами. Вирусные антигены, кодируемые ДНК, эффективно презентируются и вместе с антигенами МНС I вызывают индукцию Тх- и Тц-лимфоцитов. Таким путем они способны вызывать сбалансированный иммунный ответ, более сходный с по- стинфекционным иммунитетом, чем с иммунитетом на преформированные вирусные антигены. Другим преимуществом иммунизации ДНК является способность трансфицировать клетки без интерференции с вирусными антителами. Наконец, чужеродные антигены могут экспрессироваться in vivo в течение нескольких месяцев после ДНК-иммунизации. Однако иммунный ответ при этом может развиваться медленно. Этот метод иммунизации еще не оптимизирован, хотя предложены различные усовершенствования [1493, 1677].
Значительное усиление ответа на вакцинацию достигнуто включением плаз- мидной ДНК в микрочастицы диаметром 1—3 мкм, покрытые золотом и вводимые путем «бомбардировки» с помощью гелевого газового «пистолета» (генный пистолет). Введение таким образом 1 мкг ДНК является достаточным. В опытах с другими рекомбинантными вакцинами включали гены, кодирующие иммуностимулирующие белки, такие как интерлейкин-2, интерлейкин 12 и интерферон гамма [1245].
Преимущества ДНК-вакцин заключаются в чистоте, физико-химической стабильности, относительно низкой стоимости производства, простоте доставки, включении в одну плазмиду генов, кодирующих множество антигенов, и экспрессии антигенов в их нативной форме (что облегчает процессинг и презента
цию иммунной системе). Повторное введение не сопровождается интерференцией, но сопровождается гуморальным и клеточным (Тц и Тх) ответом. Одна из особенностей ДНК-иммунизации состоит в том, что она эффективна в присутствии материнских антител. Главным недостатком ДНК-вакцин является возможная опасность, связанная с введением чужеродной генетически измененной ДНК, интеграпия которой в хромосомную ДНК может привести к связанному с инсерцией мутагенезу или онкогенезу, индукцией аутоиммунного состояния или толератности. Плазмиды используют из-за отсутствия репликации и, более того, отсутствия саморепликации ДНК при использовании ее в качестве вакцины. Плазмиды, содержащие вирусную ДНК, конструируются без последовательностей, которые способны интегрировать ее в хромосомальную ДНК.
В последнее время введением ДНК-вакцин различным видам животных экспрессирован широкий спектр антигенов, в результате чего установлено развитие длительного гуморального и клеточного иммунитета. На различных животных моделях с использованием метода контрольного заражения показано, что ДНК- вакцины, кодирующие вирусные антигены, эффективно защищают от соответствующих инфекций [670].
Таблица 27. Показательные результаты испытания ДНК вакцин [670] (В скобках указан вид животных, на которых использовали вакцины)
Вирус |
Белки |
Индукция антител |
Индукция Тц лимфоцитов |
Защита от экспериментального заражения |
Вирус Ринотрахеита КРС |
gD |
+ |
+ |
+ (КРС) |
Вирус гепатита В |
Структурные антигены |
+ (обезьяны) |
+ (обезьяны) |
+ (обезьяны) |
Вирус гепатита С |
Нуклеокапсид |
+ |
+ |
+ (мыши) |
Вирус простого герпеса тип 1 |
gD, gB |
+ |
+ |
+ (мыши) |
ВИЧ тип 1 |
Env, Gag, Rev |
+ |
+ |
+ (обезьяны) |
Вирус гриппа |
HA, Ml,Np |
+ |
+ |
+ (цыплята, мыши) |
Вирус лимфоцитарного хориоменингита |
NP |
+ |
+ |
+ (мыши) |
Вирус бешенства |
NP, гликопротеин |
+ |
+ |
+ (обезьяны) |
Респираторно- сипцитиальный вирус |
гликопротеин |
+ |
+ |
+ (мыши) |
Источник: В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер, «Вирусы и вирусные вакцины» 2007
А так же в разделе «ДНК-вакцины »
- Классификация вирусов
- Глава 3 РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСОВ
- Цикл размножения вирусов
- Прикрепление (адсорбция) вируса
- Проникновение вируса в клетку
- Раздевание вирионов (обнажение вирусного генома)
- Синтез вирусных компонентов (эклипс-период)
- 3.2 Стратегия репликации вирусов
- РНК-вирусы
- ДНК-вирусы
- Репликация вирусных ДНК
- Репликация вирусных РНК
- 3.3. Формирование и выход из клетки вирионов
- Дефектные интерферирующие вирусные частицы (ДИ-частицы)
- Типы взаимодействия вирусов с клетками
- Глава 4 КРУПНОМАСШТАБНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ
- Клеточные субстраты
- Контаминация клеточных культур
- Выращивание вирусов
- Факторы, влияющие на размножение вирусов в культуре клеток
- Размножение вирусов в однослойной культуре
- Размножение вирусов в суспензии постоянных линий клеток
- Глава 5 ВИРУСНЫЕ АНТИГЕНЫ
- Глава 6 ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ИММУНИТЕТ
- Организация иммунной системы
- Клетки иммунной системы
- Субклеточные компоненты иммунной системы
- Синтез антител
- Типы гуморального иммунного ответа
- Клеточный иммунитет
- Эффекторные и регуляторные Т-клетки
- Иммунологическая память
- Иммунная система слизистых оболочек
- Секреторный IgA как ведущий Кооператор иммунной системы слизистых оболочек
- Роль отдельных органов в функционировании иммунной системы слизистых оболочек
- Респираторные органы
- Молочная железа
- Некоторые особенности патогенеза и иммунитета при вирусных инфекциях
- Нейтрализация вирусов
- Глава 7 МАТЕРИНСКИЙ ИММУНИТЕТ (естественый пассивный иммунитет)
- Глава 8 ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АДЪЮВАНТЫ
- Механизм действия адъювантов
- Адъюванты на основе природных субстратов
- Мурамилдипептиды
- Липосомы
- Действие адъювантов на орально вводимые антигены
- Безопасность адъювантов
- Глава 9 ВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ
- Классификация и типы вирусных вакцин
- Инактивированные вакцины
- Методы инактивации вирусов
- Химические методы
- Физические методы
- Живые вакцины
- Аттенуация вирусов
- Делеционные мутанты
- ДИЧ-мутации (образование дефектных интерферирующих частиц-ДИЧ)
- Аттенуация вируса серийными пассажами в неестественном хозяине
- Продолжительность аттенуации
- Ранняя защита после вакцинации
- Гетерологичные вакцины
- Вакцины из очищенных нативных вирусных белков
- Реассортантные вакцины
- Рекомбинантные живые векторные вакцины
- Рекомбинантные субъединичные вакцины
- Вакцины на основе вирусоподобных частиц и трансгенных растений
- Синтетические пептидные вакцины