Наиболее распространенными физическими методами инактивации вирусов являются гамма- и ультрафиолетовые (УФ) лучи.
Гамма-лучи — вид ионизирующего излучения, обладающий большой проникающей способностью. В основе действия их лежат два эффекта: прямое и непрямое воздействие. Первое заключается в непосредственном поглощении энергии излучения биологическими молекулами. Наиболее уязвимыми мишенями являются пуриновые и пиримидиновые основания [1389]. Непрямое действие — влияние на объект активных свободных радикалов Н, ОН, Н02 и молекулярных продуктов, например, перекиси водорода, образующихся в среде вследствие радиолиза воды. Перенос энергии радикалов в растворе осуществляется путем диффузии. Действие радикалов может вызвать такие изменения в ДНК, как дезаминирование оснований, дегидроксилирование, разрыв связей между дезоксирибозой и основанием, разрывы нуклеотидных цепей, окисление дезоксирибозы [73]. В результате реакций, происходящих под влиянием прямого и непрямого действия излучения, возможны различные повреждения структуры нуклеиновых кислот вирусов: разрыв водородных связей, появление сшивок, двухцепочечных разрывов. Белковая оболочка под воздействием радиации повреждается незначительно.
Инактивирующее действие гамма-лучей изучали на различных вирусах: ос- повакцины, болезни Ауески, простого герпеса, ящура, гриппа, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, бешенства, классической чумы свиней и др.
Установлено, что при воздействии гамма-лучей инфекционность вирусов теряется быстрее, чем антигенность. Так, при облучении вируса гриппа в дозе 30 кГр наблюдали полное разрушение инфекционное™ при сохранении гемагглю- тинирующей и нейраминидазной активности. Инфекционность вируса кори утрачивалась при дозе облучения 5 кГр, в то время как гемагглютинирующая активность — при 20 кГр. Гемагглютинирующая активность вирусов японского энцефалита, венесуэльского энцефаломиелита лошадей сохранялась в препаратах, в которых не обнаруживали инфекционный вирус при облучении в дозе 50—60 кГр [31]. Аналогичную устойчивость к облучению обнаружил основной группоспецифический белок VP7 вируса катаральной лихорадки овец [221].
Инактивирующий эффект гамма-лучей зависит от влажности препарата, температуры, наличия защитных средств.
Установлено, что в водных растворах вирус инактивируется значительно быстрее, чем в сухих препаратах. Более высокая скорость инактивации вирусов в водных растворах по сравнению с сухими препаратами объясняется суммарным действием прямого и непрямого эффекта. При облучении вируса в сухих препаратах, ввиду отсутствия несвязанной воды, непрямое действие практически исключается. С повышением температуры при облучении возрастает радиочувствительность вируса, которую можно ослабить введением в среду различных веществ (гистидина, цистеина, альбумина, сыворотки, желатина и др.) Для инактивации вирусов Коксаки, гриппа и полиомиелита в среде Игла с 2% сыворотки требовалось увеличить дозу более чем в три раза по сравнению с облучением в воде.
Экспериментально доказана возможность применения гамма-лучей для приготовления антигенов и инактивированных вакцин против бешенства, гриппа, оспы, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, гепатита В и других инфекций [126, 1299]. Применение гамма-излучения позволяет одновременно инактивировать и стерелизовать готовый препарат.
Эффективность УФ-лучей определяется их проницаемостью и адсорбцией биологическими молекулами. Белки поглощают УФ-лучи в меньшей степени, чем нуклеиновые кислоты, и поэтому более устойчивы к их действию.
Ультрафиолетовое облучение вызывает изменения структуры нуклеиновых кислот, заключающиеся в образовании димеров между соседними пиримидиновыми основаниями, а также ковалентных связей между нуклеиновой кислотой и белковой оболочкой. Повреждения ДНК приводят к инактивации вируса герпеса [438].
Вызывая глубокие изменения в структуре нуклеиновых кислот вирусов, УФ- лучи не оказывают существенного влияния на белковую оболочку, вследствие этого инактивированные вирусы способны сохранять свою антигенную и имму- ногенную активность.
Однако такие особенности УФ-излучения как трудность выбора и контроля оптимальной дозы, обеспечивающей инактивацию вируса с сохранением антигенных свойств, а также эффекты экранирования и фотореактивации затрудняют практическое получение безопасных инактивированных препаратов.
Основной причиной, вызывающей инактивацию вируса при нагревании, является нарушение структурной целостности его генома, вызванное разрывом и образованием внутримолекулярных связей в нуклеиновой кислоте.
Инактивированная нагреванием вакцина против вирусной геморрагической болезни кроликов оказалась достаточно иммуногенной. Она вызывала устойчивость к экспериментальному заражению на 5-90-й день после однократного введения [750а].
В процессе получения вакцины против гепатита В из плазмы крови вирусо- носителей инактивацию вируса проводили в два этапа: полуфабрикат прогревали при 103°С в течение 90 секунд, а затем инактивированный сорбированный на
фосфате алюминия антиген прогревали при 65°С в течение 10 ч. При таком способе происходила инактивация вируса гепатита и сопутствующих вирусов, которые могли присутствовать в донорской крови [936].
К простым и доступным методам инактивации вирусов относится фотодина- мическое воздействие некоторых красителей, таких как метиленовая синька, акридиновый оранжевый, толуидин синий, нейтральный красный и другие, к которым чувствительны многие вирусы. Наиболее вероятный механизм такой инактивации — изменение или отщепление гуанина без разрыва полинуклеотид- ной цепи геномов [133]. Фотодинамическую инактивацию применяли при изготовлении экспериментальных образцов инактивированных препаратов против клещевого энцефалита, краснухи, болезни Ауески, классической чумы свиней и других вирусов [372, 373]. Обработка вируса Сендай родамином-В, бриллиантовым зеленым и фиолетовым Гофмана сопровождалась частичной модификацией РНК без изменения капсидных белков. Инактивированный препарат обладал высокой иммуногенностью [1079].
Основные показатели качества инактивированных препаратов, предназначенных для профилактической вакцинации, — безопасность и высокая иммуно- генность.
При оценке качества ряда инактивированных препаратов первостепенное значение приобретает контроль авирулентности, направленный на выявление оставшихся жизнеспособных вирионов. Считается, что чем опаснее возбудитель, тем надежнее должны быть условия инактивации и методы контроля ее эффективности. Степень безопасности инактивированных вакцин находится в неразрывной связи с чувствительностью тест-системы, по которой оценивают полноту инактивации вируса. В связи с этим разработка наиболее чувствительных и совершенных методов обнаружения минимальных количеств живого вируса в инактивированных препаратах имеет большое значение. Следует иметь в виду, что, несмотря на стремление достичь полной инактивации вирусных частиц, всегда остается статистическая вероятность того, что какая-то часть из них может выдержать соответствующую обработку. Риск существования очень небольших количеств остаточного инфекционного вируса повышается по мере увеличения масштабов применения вакцины [60].
Для определения полноты инактивации вируса в инактивированной вакцине используют чувствительные культуры клеток и восприимчивых животных. В практике производства инактивированных вакцин методы контроля на авиру- лентность особенно тщательно разработаны для вакцин против полиомиелита, бешенства, ящура, клещевого энцефалита и других наиболее опасных инфекций человека и животных.
Специфическую безвредность инактивированной вакцины против полиомиелита определяют в культуре клеток и на обезьянах. Основным методом при этом является контроль в культуре клеток почки обезьян. Экспериментальные исследования по изучению условий, повышающих возможность обнаружения минимальных количеств живого вируса в культуре клеток, показали, что сущест
венное значение имеет способ обезвреживания свободного формальдегида, объем вакцины для исследования и срок наблюдения. Нейтрализация бисульфитом натрия несвязанного формальдегида в вакцине было предпочтительнее удаления его диализом. Выбор количества вакцины, наблюдаемой для испытания ее безопасности, обосновывали, исходя из теории вероятности. Согласно американским требованиям, в культуре клеток должно быть исследовано не менее 1500 мл каждой выпускаемой серии вакцин. Кроме культуры клеток, безопасность по- лиомиелитной вакцины оценивают по результатам наблюдения в течение 28 дней за состоянием привитых обезьян и последующего изучения гистологических изменений в центральной нервной системе [102].
Опыт производства вакцины против полиомиелита во многих странах показал, что комбинированный способ контроля в культуре клеток и на обезьянах в сочетании с инактивацией фильтрованной вирусной суспензии гарантировал высокую степень безопасности препарата.
Авирулентность инактивированных вакцин против ящура определяли на крупном рогатом скоте, свиньях, лабораторных животных и в культуре клеток. Наиболее чувствительным считали испытание вакцины на крупном рогатом скоте. Критерий безопасности (авирулентности) вакцины — отсутствие признаков ящура у животных в течение 10 дней после введения ее в слизистую оболочку языка. Этот метод использовали во многих странах мира [297]. Однако метод контроля авирулентности противоящурных вакцин на крупном рогатом скоте дорог, громоздок и не всегда гарантирует обнаружение минимального количества инфекционного вируса. В Италии и ряде стран Южной Америки контроль авирулентности осуществляли на мышах-сосунах. Каждую серию вакцины вводили внутрибрюшинно 40—50 животным, специфичность гибели мышат подтверждали в РСК.
Высокая чувствительность ряда культур клеток к вирусу ящура позволяла использовать их для оценки безопасности противоящурных инактивированных вакцин [297].
Метод*контроля авирулентности инактивированной вакцины против катаральной лихорадки овец оказался довольно сложным. В итоге, присутствие вируса в вакцине выявляют пассажами в чувствительной культуре клеток непосредственно из инактивированной вакцины и из крови вакцинированных овец в момент предполагаемой вирусемии - через 7-9 дней после прививки. Кроме того, кровью вакцинированных овец прививают группу овец, у которых, спустя 21 день, определяют сероконверсию и устойчивость к контрольному заражению гомологичным вирулентным штаммом вируса. Несмотря на некоторую сложность, принятая схема испытания безопасности инактивированной вакцины против KJ10 является весьма надежной [170].
Инактивированные антирабические вакцины контролируют на белых мышах. Готовый препарат вводят мышам (10 голов) интрацеребрально, а через 10 дней проводят слепой пассаж на мышах. Все мыши должны оставаться здоровыми в течение 14 суток с момента инокуляции. Специфичность заболевания и
гибели животных подтверждают методом флуоресцирующих антител. Пассаж вакцины в культуре клеток с последующим внутримозговым введением культуральной жидкости белым мышам значительно повысил эффективность обнаружения остаточного вируса в препарате по сравнению с методом слепых пассажей только на мышах. Этому способствовали высокая чувствительность культуры клеток, а также большое количество (30-40 мл) исследуемой вакцины.
Для контроля авирулентности инактивированной вакцины против клещевого энцефалита наиболее надежным признан метод, сочетающий одновременное испытание вакцины в культуре клеток и на мышах 1169].
Авирулентность инактивированных культуральных вакцин против многих вирусных болезней человека и животных оценивают в течение нескольких пассажей (не менее трех) в культуре клеток, которую использовали для выращивания конкретного вируса при изготовлении вакцины.
При контроле «эмбриональных» инактивированных вакцин полноту инактивации вируса определяют на эмбрионах соответствующих видов птиц.
Следует отметить, что наряду с очевидными достижениями в области инактивированных вирусных вакцин иммуногенность ряда препаратов отвечает лишь минимальным требованиям, а при некоторых заболеваниях (корь, респираторно-синцитиальная инфекция) вообще не удалось получить сколько-нибудь выраженного протективного эффекта за счет применения этого класса препаратов. Объясняется это тем, что во многих случаях трудно достичь сочетания гарантированной безопасности и высокой эффективности.
Это относится, прежде всего, к вакцинам против особо опасных возбудителей, при изготовлении которых приоритет отдается безопасности, даже если это идет в ущерб эффективности. Например, вирус гепатита А в культуральной среде в присутствии формалина (1:4000) не выявляли через 97 ч инкубации при 35°С. Однако для полной гарантии инактивации вируса его инкубировали при указанных условиях в течение 10 дней [333]. При изготовлении вакцин против других особо опасных заболеваний продолжительность инактивации вируса обычно превышает минимальную в 2 и более раз, что, естественно, сказывается на снижении их иммуногенности.
Возникающие трудности удается в значительной мере преодолеть, если для изготовления инактивированной вакцины используют аттенуированные штаммы вируса. Это обстоятельство позволяет несколько ослабить режим инактивации вируса без существенного риска уменьшения безопасности препарата. Классическим примером такого решения может служить изготовление многочисленных инактивированных вакцин против бешенства из аттенуированных штаммов вируса. Даже полностью авирулентный для мышей штамм (TAG-1) вируса бешенства оказался в равной мере пригодным для изготовления живой и инактивированной вакцин [1521]. Показана возможность приготовления инактивированной вакцины из аттенуированных штаммов полиовируса, сравнимой по иммуногенности с вакциной из вирулентных штаммов [210]. В нашей лаборатории получены иммуногенные инактивированные препараты из аттенуирован
ных вакцинных штаммов вирусов болезни Ауески, катаральной лихорадки овец и других сложноустроенных вирусов.
Анализ приведенных данных показывает, что, несмотря на то, что основные принципы контроля инактивированных вакцин на авирулентность одинаковы, методы испытания конкретных вакцин могут существенно отличаться. Индивидуальный подход определяется свойствами вируса, особенностями болезни, чувствительностью биологических моделей. Наиболее универсальным и общепризнанным методом является испытание инактивированных препаратов в чувствительных культурах клеток. Однако при оценке безопасности некоторых вакцин пользуются сложным комплексным подходом.
Анализируя сказанное, можно заключить, что одной из проблем получения инактивированных вакцин является изыскание безупречного способа инактивации вирусов, обеспечивающего необратимое повреждение его репликативного механизма при полном сохранении исходной антигенной структуры. Поскольку решить эту задачу во многих случаях пока не удалось, иммуногенность инактивированных вакцин повышают за счет использования концентрированных вирусных суспензий и адъювантов. Для приготовления инактивированных вакцин против различных заболеваний применяют химические методы инактивации вирусов. Внимание исследователей к формальдегиду по-прежнему не ослабевает; несмотря на недостаточную иммуногенность формолвакцин против некоторых инфекций, существует необходимость изыскивать новые методы инактивации, позволяющие полностью подавлять инфекционность вирусов без существенного изменения антигенных свойств вакцин. Перспективным является использование азиридинов, глютаральдегида и бета-пропиолактона, а также применение нетрадиционных способов инактивации вирусов.
Физические методы инактивации из-за трудности контролируемого дозирования особенно при крупномасштабном производстве пока не получили практического применения. С помощью химических методов можно приготовить вакцины почти из любого вируса, однако они могут сильно различаться по иммуно- генности. Причина такого разнообразия пока недостаточно ясна. В одних случаях это может быть следствием повреждающего и денатурирующего действия инактивирующих агентов на вирусные антигены, в других — слабой антиген- ности вируса, когда даже естественное переболевание не сопровождается образованием выраженного иммунитета.
В повышении иммуногенности инактивированных вакцин важная роль принадлежит адъювантам. Несмотря на крупные успехи в создании инактивированных вакцин, многие из них пока не обеспечивают такой напряженной и длительной защиты, как живые. Несмотря на это, против некоторых болезней созданы достаточно эффективные инактивированные вирусные вакцины, являющиеся на сегодня единственно приемлемыми препаратами для специфической профилактики.
Иммуногенность инактивированной вакцины в значительной степени зависит от наличия и вида адъюванта. Включение ГОА в состав вакцин увеличило их
активность во много раз [307]. В вакцинах для человека в качестве адъюванта используют только ГОА. В вакцинах для животных используют различные адъюванты. Для крупного и мелкого рогатого скота в качестве адъюванта чаще применяют ГОА с сапонином [1112]. Для свиней чаще применяют эмульгированные вакцины. Эмульгированные моно- и поливалентные вакцины оказались более иммуногенными не только для свиней, но и для крупного рогатого скота [1294].
Вакцины с масляным адъювантом создавали у телят более выраженный и продолжительный иммунитет, чем ГОА-вакцина [1294]. У 1-месячных телят с колостральным иммунитетом отсутствовал иммунный ответ на введение водных антигенов, тогда как аналогичные телята, привитые вакциной с масляным адъювантом, реагировали иммунологически так, как взрослые животные [1353].
Иммуногенность инактивированных вакцин для птиц подобным образом зависит от вида адъюванта.