Для одних целей предпочтительнее использовать клетки, растущие на поверхности субстрата, для других — клеточные суспензии. Даже первые несовершенные исследования по культивированию вирусов в суспензиях постоянных линий клеток показали перспективность этого метода для получения вирусов в больших количествах.
За сравнительно короткий период выращивание вирусов животных в суспензиях клеток достигло впечатляющих успехов. Большие достижения в этой области связаны, прежде всего, с технологией выращивания вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21. Ввиду высокой чувствительности ко многим вирусам и потенции роста клетки ВНК-21 получили широкое применение. Внимание многих исследователей было обращено на разработку методов массового выращивания этих клеток. Возможность автоматического регулирования pH, аэрации, температуры, а также усовершенствование питательных сред создали предпосылки для суспензионного культивирования клеток ВНК-21 в реакторах большой емкости.
В 1962 г. Кэпстик и сотрудники [445] впервые сообщили о выращивании клеток ВНК-21 в суспензии без ослабления их чувствительности к вирусу ящура. Затем было установлено, что вирус ящура, размноженный в суспензии клеток ВНК-21, вполне пригоден для получения инактивированной вакцины [446].
Полученные результаты стали основанием для разработки промышленной технологии культивирования клеток ВНК-21 с целью изготовления инактивированной противоящурной вакцины [447, 1499].
Дальнейшие исследования [447] показали, что вирус максимально накапливался при 35°С. С повышением температуры ускорялась гибель клеток, а при ее
снижении до 34—25°С ослаблялась репродукция вируса. Максимальный титр наблюдался при pH 7,2, снижение или повышение pH до 6,8 и 7,8 подавляло размножение вируса. Повышение концентрации клеток в пределах 1,0—9,0 млн/мл заметно не влияло на титр вируса, хотя при этом активность КС-антигена повышалась. Концентрация клеток в пределах 2,0—2,5 млн/мл обеспечивала накопление вирусного антигена, необходимого для изготовления эффективной вакцины, что было подтверждено в опытах на крупном рогатом скоте. Для получения максимального выхода вируса множественность заражения (М) должна быть не менее 0,003. Время достижения пика инфекционности вируса при М = 0,003— 1,0 существенно не изменялось. Добавление к питательной среде 5% сыворотки крупного рогатого скота вело к увеличению выхода вируса и КС-антигена в 3—10 раз, чего не наблюдали при выращивании вируса ящура в однослойной культуре клеток ВНК-21. Однако некоторые партии сывороток содержали неспецифические ингибиторы, снижающие накопление вирусного антигена на 50%. Применение сыворотки лошади давало возможность избежать подавления размножения вируса.
Для производства противоящурной вакцины [1499) клетки ВНК-21 выращивали в металлических аппаратах в течение 50 ч до концентрации 2-2,5 млн/мл. После осаждения клеток методом отстоя (в течение 18—24 ч при 15°С) 90% ростовой среды заменяли средой с 5% сыворотки телят. Для заражения клеточной суспензии в объеме 100 л (численность популяции 2x10й клеток) было достаточно внести 1 л адаптированного культурального вируса с титром 108,5— Ю9,0 БОЕ/мл. В процессе культивирования большинство клеток разрушалось в результате ЦПД вируса. При изготовлении вакцины вирусную суспензию осветляли фильтрованием вначале через крупнопористый фильтр, затем через нитро- целлюлозную мембрану (диаметр пор 0,2 мкм). Вирус инактивировали 0,05%- ным ацетилэтиленимином в течение 30 ч при 25°С (pH 7,6). Приготовленная таким образом вакцина обладала выраженной иммуногенностью.
Французские исследователи выращивали клетки ВНК-21 в реакторах из нержавеющей стали емкостью 100 л. Автоматическое поддержание pH на оптимальном уровне способствовало росту культуры, популяция которой увеличивалась в 7-8 раз в течение 72—96 ч. В выросшей культуре заменяли 90% ростовой среды поддерживающей средой (среда Игла, гидролизат лактальбумина и дрожжевой экстракт), вносили вирус и суспензию, перемешивали (400 об/мин). Они установили, что повышение концентрации клеток в суспензии выше 2x106 мл не повышает титра вируса. Наивысшее накопление КС-антигена отмечено при концентрации клеток в суспензии 107 мл. Хранение суспензии клеток при 6°С в течение семи дней практически не отражалось на их способности к репродукции вируса ящура. Инактивированные вакцины, приготовленные из вируса ящура, выращенного в суспензии клеток ВНК-21 (концентрация клеток 2,5 млн/мл) и по методу Френкеля, оказались аналогичными по иммуногенности.
В 1971 г. восемь ящурных лабораторий, расположенных в Англии, Кении, Аргентине, Уругвае, Бразилии, Парагвае, Испании и Германии использовали су-

Рис. 15. Типовая схема процесса циклического производства вируса в суспензионной культуре
спензию клеток ВНК-21 для промышленного изготовления противоящурной вакцины. Ежегодно эти лаборатории производили свыше 200 млн доз моновалентной вакцины. Клетки и вирус выращивали в реакторах емкостью 2000 л при контролируемых условиях (температура, pH и аэрация). Для изготовления вакцины использовали коллекцию из 100 адаптированных штаммов, представляющих 33 иммунологических варианта вируса ящура. Большинство из этих штаммов обладали высокой иммуногенностью и хорошо размножались в суспензионной культуре клеток ВНК-21 (рис. 15).
Многолетние исследования по оптимизации условий выращивания клеток ВНК-21 в суспензии увенчались еще одним важным достижением. Радлетт и сотрудники [1288] предложили среду 7М, которая обеспечивала исключительно высокое накопление клеток ВНК-21 (6,5-7,0х106/мл) в суспензии (табл. 13).
При начальной концентрации клеток около 5x105 мл культура вступала в экспоненциальную фазу роста через 10—12 ч. В этот период продолжительность генерации составляла около 14 ч (константа скорости роста 0,05 ч). Наиболее критическими факторами, ограничивающими рост клеток, оказались глютамин и глюкоза, содержание которых в новой среде было повышено до оптимального уровня. Добавление гидролизата лактальбумина (5 г/л) повышало концентрацию глютамина в среде до 10—12 мМ. Поскольку глютамин в концентрации более чем 10 мМ (1,46 г/л) оказывает цитотоксический эффект, авторы считают целесообразным добавлять его в среду дозировано, периодически, по мере ее истощения.
При промышленном выращивании различных типов вирусов ящура в суспензии клеток ВНК-21 с успехом применяли среду Игла с добавлением 0,3% триптозофосфатного бульона и 8% сыворотки крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ-6000. В 300-литровом ферментере при 37 °С, pH 7,3 и скорости перемешивания 100 об/мин через 24—48 ч концентрация клеток повышалась с 0,4—0,9 млн/мл до 1,6—2 млн/мл. Заражение таких культур позволило регулярно получать качественное сырье (229 партий из 231) для изготовления вакцины.
Несмотря на высокую производительность, культивирование вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21 имеет два недостатка: необходимость смены среды перед заражением вирусом и включение в ее состав сыворотки. Первый обременяет технологический процесс, второй может быть причиной анафилактических осложнений при вакцинации [1499].
Таблица 13. Среда «Пирбрайт 7М» для выращивания клеток ВНК-21 в суспензии [1288]

Компонент	Концентрация, мг/л	Компонент	Концентрация, мг/л
1-аргинин	8,4	Рибофлавин	0,32
1-цистин	4,8	Холинхлорид	3,2
1-гистидин	3,84	Фолиевая кислота	3,2
1-изолейцин	10,48	Никотинамид	3,2
1-лейцин	10,48	Тиамин НС1	3,2
1-лизин НС1	14,62	Пантотенат кальция	3,2
1-фенилаланин	6,6	Пиридоксаль- НС1	3,2
1-треонин	9,52	Инозитол	0,7
1-триптофан	1,6	NaCl	5120
1-тирозин	7,24	КС1	321
1-валин	9,36	MgS04 х 7Н20	160
1-метионин	3,0	NaH2P04 х Н20	112
1-глютамин	9,32	СаС12	160
Гидролизат лактальбумина	5000	Fe(N03)3 х 9Н20	0,08
Триптозо-фосфатный бульон (порошок)	2000	NaHC03	2200
Фенолрот	8	Глюкоза	6200
Pluronic F 68*	1000	Эмульсия для гашения пены	0,4 мл
		Сыворотка крупного рогатого скота	100 мл

* Полимер, ограничивающий образование белковых преципитатов, препятствую щих размножению клеток в суспензии.
Кроме клеток ВНК-21 для культивирования вируса ящура в последнее время была использована постоянная линия клеток почки поросят IBRS-2, адаптированная к суспензионному культивированию. Клетки выращивали при pH 7,4, температуре 36,5°С и непрерывном перемешивании суспензии (350 об/мин). Через 48 ч культивирования концентрация клеток повышалась более чем в 3 раза. Эти клетки оказались высокочувствительными к вирусу ящура. Максимальное накопление вируса (7,7—8,7 lg ТЦД^/мл) в суспензии клеток IBRS-2 наблюдали через 18—24 ч после заражения, а КС-антигена — через 32—48 ч. Инактивирован
ная вакцина, приготовленная из такого вируса, имела хорошую иммуногенность [474] и не уступала инактивированной вакцине из вируса ящура, размноженного в суспензии клеток ВНК-21 (при равном титре инфекционное™ и активности КС-антигена). В силу выраженной способности вируса ящура к мутациям, его популяция в процессе репликации в культуре клеток (ВНК-21 или IBRS-2) в течение небольшого количества пассажей представляет собой смесь генетических вариантов.
Суспензию клеток IBRS-2 использовали для размножения вируса везикулярной болезни свиней. Клетки выращивали в среде Игла с триптозо-фосфатным бульоном (0,2%) и 10% сыворотки телят. При заражении вирусом концентрацию сыворотки снижали до 5%. В суспензию клеток (106 клеток/мл) вносили вирус (М=10) и инкубировали при 35°С, pH 7,2. Вирус максимально накапливался (108,8 БОЕ/мл) через 16-24 ч.
Технология культивирования клеток ВНК-21 в реакторах емкостью 1000 л, разработанная для получения вируса ящура, оказалась весьма перспективной для промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства из штамма Lep Flyry.
Клейн и сотрудники [169] описали размножение вируса лихорадки долины Рифт в суспензионной культуре клеток L. Клетки хранили при —175°С и выращивали поэтапно, вначале во встряхиваемых колбах и стеклянном ферментере емкостью 7,5 л, затем в 50-литровом металлическом реакторе. Клетки выращивали в модифицированной минимальной среде Игла с 10% сыворотки крупного рогатого скота; pH 7,0±0,1 поддерживали на этом уровне добавлением кислоты или щелочи, а ОВП 75 mV — автоматически с помощью аэрации (95% 02 + 5% С02 или 95% воздуха + 5% С02). Газ подавали под мешалку турбинного типа (100 мл/мин) или над поверхностью жидкости (500 мл/мин). Двойная аэрация сопровождалась лишь небольшим образованием пены и устраняла необходимость применения пеногасителя. При разбавлении суспензии клеток свежей средой (1:10) через пять дней их концентрация достигала максимального значения — 2,5х106 мл. Поскольку вирус наиболее интенсивно размножался в делящихся клетках, то их рассевали, когда плотность популяции приближалась к 2x106 клеток/мл. При этом поступали следующим образом. Ростовую среду вносили в реактор, устанавливали температуру 25°С, добавляли клетки (Зх105/мл), вносили вирус (М=1), устанавливали pH 7,4±0,1; ОВП на 75 mV и повышали температуру до 37°С постепенно, в течение 4—6 ч (для лучшего сохранения жизнеспособности клеток). Через 48—72 ч после заражения вирус накапливался в максимальном титре 8,0—9,0 lg ЛД50/мл.
Суспензионная культура постоянной линии клеток простаты человека (MAI 60) обеспечивала репликацию штамма Эдмонстон вируса кори на высоком уровне. Выход его составлял 150—800 БОЕ на клетку и примерно в 25 раз превышал выход вируса в однослойной культуре.
Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) выращивали в циклической суспензионной культуре постоянной линии клеток почки поросенка
ППК-66. При оптимальных условиях (концентрация клеток 1,5—2,5 млн/мл; множественность заражения 1— 10 ТЦД50/мл; продолжительность культивирования после инфицирования 24—30 ч; содержание сыворотки в среде — 5—10%; pH - 7,2-7,4; скорость перемешивания суспензии 120-200 об/мин и аэрация со скоростью 0,2—1 л/ч на литр среды) вирус накапливался в титре Ю8 5—Ю9,0 ТЦЦ50/мл и в 100 раз превышал накопление вируса в однослойной статической культуре тех же клеток. Титры антител в крови кроликов, двукратно иммунизированных инактивированной вакциной, были значительно выше при ее приготовлении из вируса, размноженного в суспензионной, чем в однослойной культуре клеток. Установлено, что суспензионная культура клеток ППК-66 является высокопродуктивной системой для крупномасштабного производства вакцинного штамма вируса ТГС.
Аналогичные данные получены при выращивании вируса болезни Ауески в суспензионных культурах клеток ППК-666 и ВНК-21. Накопление вируса в суспензии (108,5— Ю9 0 ТЦД50/мл) было выше, чем в монослое. В обоих случаях для выращивания вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и болезни Ауески в суспензии клеток использовали среду с ФГМ и 10% сыворотки крупного рогатого скота [169].
Накопление вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в клетках L, выращенных в суспензии, было таким же, как и в однослойной культуре. Однако выход вируса на одну клетку в суспензии был ниже, чем в монослое, и в среднем достигал 1000 ЛД50/мл. Респираторно-синцитиальный вирус размножали в суспензии клеток НЕр2 и МА-160. Вирусную суспензию смешивали с клеточным осадком (М-5), добавляли среду Игла с 10% сыворотки телят до концентрации клеток 2—ЗхЮ5 мл. Через 48 ч вирус достигал титра 7,0 lg ТЦД50/мл. Высокая им- муногенность препарата, инактивированного формалином (1:2000), явилась основанием для разработки метода выращивания вируса в суспензионной культуре в ферментерах. Вирусы полиомиелита трех типов хорошо размножались в суспензии лимфобластоидных клеток человека в бессывороточной среде. Данная клеточная система открывает новые возможности получения больших количеств вируса для промышленного изготовления вакцины. Линии лимфоидных клеток (JMV-I и MSB-I), полученные от зараженных вирусом болезни Марека цыплят, поддерживали репликацию вируса ньюкаслской болезни, что сопровождалось цитолитическим действием.
Хемостатные суспензионные культуры представляют возможность для увеличения производительности при репродукции вирусов по сравнению с обычными циклическими суспензионными культурами. Выбор системы непрерывнопроточного культивирования зависит от особенностей вируса и чувствительного клеточного субстрата. Вирусы, реплицирующиеся без цитопатического эффекта и без выраженного снижения скорости роста клеток, могут размножаться в системе одноступенчатого хемостата. Вирусы, вызывающие литическую инфекцию, необходимо культивировать во второй ступени хемостата, а клетки-продуценты — в первой. Преимущество хемостатной системы состоит также в непрерыв
ном удалении образовавшегося продукта. В одноступенчатом хемостате культивировали вирус краснухи в клетках HeLa и ВНК-21. Отмечено, что в течение 40 дней непрерывной работы хемостата поддерживался титр продуцируемого вируса и комплементсвязывающего антигена. С увеличением скорости роста клеток увеличивалась репродукция вируса. Полиовирус, вызывающий литическую инфекцию, размножали в клетках HeLa в одноступенчатом хемостате (лизостате), а аденовирус - в двухступенчатой системе. Однако эти попытки не дали четких результатов.
Для культивирования клеток в суспензии предложен (1998 г.) качающийся биореактор (Wave bioreactor), представляющий собой пластиковую эластичную емкость (мешок), содержимое которого перемешивается с помощью плавного покачивания в вертикальной плоскости на специальной качалке (рис. 16).
Пластитковый биореактор стерилизуется гамма-лучами. При культивировании клеточной суспензии в объеме gt; 10 л, используют аэрацию с автоматизированным контролем pH, 02 и С02.
Перспектива использования постоянных линий клеток для выращивания вирусов с целью изготовления вакцин привела к необходимости выяснить опасность таких препаратов. Прежде всего, это было связано с клетками ВНК-21 и противоящурной вакциной. Онкогенность клеток ВНК-21 для хомяков хорошо известна. Предстояло выяснить онкогенность их для домашних животных, прививаемых против ящура. Во-первых, было установлено, что у хомяков опухоли вызывают только нативные клетки ВНК-21, тогда как различные культуральные бесклеточные субстраты этой способностью не обладают. Во-вторых, у других видов животных (крупный рогатый скот, овцы, свиньи, крысы, кролики, морские свинки и мыши) клетки ВНК-21 не вызывали опухолей.
Постоянный технический комитет экспертов Европейской комиссии по борьбе с ящуром ФАО рекомендовал клетки ВНК-21 для изготовления вакцины, признав их безопасными для сельскохозяйственных животных. Многолетняя практика применения ВНК-вакцины против ящура подтвердила правильность этой рекомендации. Возможность применения других линий клеток в изготовлении противовирусных вакцин, предназначенных животным, должна основываться на соответствующих экспериментальных данных.
Анализ имеющихся данных показывает, что выращивание вирусов в суспензии постоянных линий перевиваемых клеток все более привлекает внимание исследователей в связи с решением различных научных и практических вопросов. Для некоторых вирусов разработаны технологические режимы массового раз

ные. 16. Схематическое изображение качающегося биореактора.
множения в клеточных линиях с использованием металлических реакторов большой емкости. Одни и те же клеточные субстраты можно с успехом применять для размножения разных вирусов. Например, технология культивирования клеток ВНК-21, разработанная в связи с изготовлением противоящурной вакцины, имеет прототипное значение и может быть применена для размножения многих вирусов человека и животных. Разработка таких технологий массового культивирования постоянных линий клеток многоцелевого назначения представляет огромный практический интерес. Актуальной задачей является создание банка охарактеризованных постоянных линий клеток, отличающихся высокой ростовой потенцией, стабильностью свойств при серийном суспензионном культивировании в промышленных условиях и высокой продуктивностью для различных вирусов.