Совершенствование или создание новых вакцин требует знаний структурных и функциональных особенностей вирусных антигенов, различаемых иммунной системой организма.
Вирусными антигенами называются продукты вирусспецифического синтеза, несущие признаки чужеродной генетической информации и вызывающие иммунный ответ. К ним относятся структурные и неструктурные вирусные белки.
Защита от вирусной инфекции зависит от выраженности иммунного ответа на антигены, расположенные на поверхности вирионов или инфицированных клеток. Иммунный ответ на неструктурные вирусные антигены играет меньшую роль в защите от инфекции.
Однако у герпесвирусов, например, клеточный иммунный ответ индуцируется множеством вирусспецифических белков, не входящих в структуру вирионов. Белки герпесвирусов эксперссируются каскадно (а, (3, у) и большинство нестук- турных белков синтезируется на ранней стадии репликации вируса. После процессинга они презентируются МНС классом I (главным комплексом гистосовместимости, класс I) на плазматической мембране инфицированных клеток и распознаются специфическими цитотоксическими Т-клетками. Поэтому инфицированные клетки могут различаться эффекторными цитотоксическими Т-лимфоцитами до завершения цикла вирусной репликации.
Каждый вирус представляет собой сложную смесь антигенов, определяемую в первую очередь структурными белками. Являясь сложными корпускулярными антигенами вирусы обычно вызывают выраженный иммунный ответ и большая часть их белков способна вызывать синтез специфических антител. Вирусные белки неравнозначны по своей антигенной активности. Наиболее явные и доступные мишени для иммунного ответа — белки, расположенные на поверхности вирусных частиц. Это прежде всего относится к вирусным гликопротеинам, расположенным на поверхности вирусных частиц, и экспрессированным на поверхности зараженных клеток.
Гликопротеины поверхности оболочечных вирусов и капсидные белки без- оболочечных вирусов являются главными протективными антигенами [169 1130].
Под специфичностью вирусного антигена подразумевают его способность избирательно реагировать с антителами или сенсибилизированными лимфоцитами, являющимися ответом на введение данного антигена. Участок антигена, который узнается специфическим лимфоцитом, и с которым впоследствии взаимодействует специфическое антитело, называется антигенной детерминантой.
Иммунологическая специфичность определяется не всей молекулой антигена, а лишь входящими в ее состав антигенными детерминантами (эпитопами). Участки вирусного белка, индуцирующие образование антител и специфически связывающиеся с ними, принято называть антигенными участками (доменами) [1667]. Антитела соответствующей специфичности образуются к каждой антигенной детерминанте. Антитела к определенной детерминанте реагируют только с ней или с другой очень сходной структурой. Специфичность антигена определяется совокупностью детерминант, а его валентность — количеством однородных антигенных детерминант. Антигенность детерминант зависит от их пространственной структуры и размера молекулы антигена.
Антигенные детерминанты состоят обычно из 10—20 аминокислотных остатков и содержат гидрофильные группы. Наиболее гидрофильными аминокислотами являются лизин, аргинин, аспарагиновая кислота и глютаминовая кислота. Считается, что те участки молекулы белка, в которых их содержание относительно велико, предпочитают водное окружение и поэтому располагаются на поверхности. Различают линейные (непрерывные) и конформационные (прерывистые) детерминанты. Антитела образуются преимущественно к конформацион- ным детерминантам, расположенным, как правило, на поверхности вирионов, и зависят от третичной структуры молекулы антигена. Антигенная и иммуноген- ная активность вирусов определяется, главным образом, конформационными эпитопами. Разные антитела различают специфические антигенные участки вирусных антигенов. Например, прикрепительный гликопротеин (HN) вируса парагриппа имеет, по крайней мере, 6 антигенных сайтов, три из которых различаются нейтрализующими антителами [510].
Денатурация белков приводит к потере некоторых конформационных детерминант, обнажая ранее экранированные детерминанты. В результате денатурации белки частично или полностью изменяют антигенную специфичность, что может отразиться на иммунном ответе.
Вирионные белки разных вирусов различаются типоспецифичностью и вариабельностью. Одни из них обладают высокой вариабельностью, другие характеризуются консервативностью. Группоспецифические антигены являются вы- сококонсервтивными, находятся обычно внутри вирионов и могут быть сходными у нескольких представителей рода данного семейства вирусов. Например, субвирусные частицы 12S вируса ящура содержат высококонсервативный белок, который выявляется моноклональными антителами одной специфичности у ше
сти из семи известных типов вируса [1428]. Однако иммунизация ими не сопровождалась образованием ВН-антител.
Типоспецифические антигены связаны с вариабельными областями белков, обычно расположенными в наружных частях вирионов, и обладают узкой специфичностью, присущей одной группе вирусов.
У антигенных вариантов полиовируса устойчивость к нейтрализующим антителам сопровождалась аминокислотными заменами во всех трех наружных капсидных белках. Основным результатом «иммунологических» мутаций вируса ящура во время эпизоотических вспышек (антигенный дрейф) является изменение аминокислотной последовательности в одном капсидном белке VP1 [1129].
Развитие выраженного иммунного ответа против нескольких антигенов, в том числе группоспецифических, еще не гарантирует устойчивости к заражению. Подобное явление имеет место при инфекционной анемии лошадей вследствие вариабельности белка оболочки (env) несмотря на выраженный иммунный ответ на более консервативный внутренний антиген (gag) [1577].
С точки зрения участия Т-хелперов в образовании антител различают тиму- сзависимые и тимуснезависимые антигены. К первым относится большинство антигенов, ко вторым — антигены более простого строения с повторяющимися последовательностями. Тимуснезависимые антигены взаимодействуют непосредственно с В-клетками, поэтому для образования антител взаимодействия В- клеток с Т-хелперами не требуется [96, 107, 165, 200]. Большинство изученных вирусов оказалось Т-зависимыми антигенами. Их иммуногенность в значительной степени определяется количеством антигенных детерминант, распознаваемых Т-хелперами.
В вирусологической практике антигенностью обычно принято называть способность антигена вызывать иммунный ответ, а иммуногенностью — сообщить организму специфическую устойчивость к определенному возбудителю [116]. Имеется, однако, иная, более широкая трактовка этих понятий. Способность антигенов вступать в реакцию с антителами называют антигенностью, а способность их вызывать иммунный ответ (гуморальный или клеточный) — иммуногенностью.
Антигены, играющие основную роль в противовирусном иммунитете, принято называть протективными антигенами [1131]. Под протективной активностью антигена понимается его способность защищать иммунизируемый организм от инфицирования или заболевания (при ограничении размножения и распространения вируса). За иммунологическую специфичность и особенно за индукцию протективного иммунитета ответственно небольшое количество потенциально антигенных участков. К протективным антигенам относят белки поверхности вирионов и вирусспецифические антигены, экспрессирующиеся на поверхности инфицированных клеток. Протективные антигены, как правило, представлены более чем одним белком или гликопротеином. Они имеют полимерную структуру и играют основную роль в развитии иммунитета.
В связи с многомишенной антигенной структурой многих вирусов для их эффективной нейтрализации необходимы антитела различной специфичности и соответствующие антигены для создания протективного иммунитета.
В инфицированном организме не все индивидуальные антитела имеют доступы ко всем антигенным сайтам вируса. Они обычно не имеют прямого доступа ко многим функциональным сайтам вирусных протективных антигенов, таких как: рецептор — связывающий сайт; сайты, обладающие ферментативной активностью, и домены слияния. Эти участки в большинстве спрятаны внутри структуры белка протективного антигена. В этих случаях антитела обычно действуют другим способом, чем прямая инактивация функциональных сайтов на поверхности антигенов. Антитела действуют прямо или косвенно, препятствуя прикреплению вируса к клетке, или его раздеванию после прикрепления или проникновению в клетку. Кроме структурных белков вируса, протективный иммунный ответ может быть направлен на неструктурные белки, расположение на поверхности инфицированных клеток. Например, таких как NS1 вируса денге или Т-антиген вируса обезьян 40 (SV40) [1130].
Согласно концепции Р. Лернера [938, 942], в составе вирусных белков имеются антигенные участки, не проявляющие активности в процессе вакцинации или инфекции, которые, будучи представленными в виде коротких пептидов, способны индуцировать выработку специфических антител. Из этого следует, что представляя антиген иммунной системе «по кусочкам», можно значительно расширить спектр иммунного ответа на данный антиген. В опытах с ротавирусом было установлено, что, если VP7, обычно локализованный в эндоплазматичес- ком ретикулуме и обладающий слабой антигенностью, экспрессировать на клеточной поверхности, то его способность индуцировать гуморальный и клеточный иммунитет возрастает во много раз [145].
Детерминанты вирионных белков, к которым прикрепляются нейтрализующие антитела, называют нейтрализующими антигенными участками. Нейтрализующий антигенный участок может быть представлен несколькими нейтрализующими эпитопами, различающимися между собой [1667]. Например, модель антигенной структуры парамиксовирусов птиц выглядит следующим образом: каждый вирион содержит определенное число идентичных молекул HN, каждая молекула HN содержит 2 домена НА и NA, каждый домен содержит идентичные или отличные друг от друга антигенные детерминанты (эпитопы) [755]. На молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа находятся два типа нейтрализующих антигенных детерминант: непрерывный (линейный) антигенный участок и кон- формационная детерминанта. Антигемагглютинирующая активность и способность к нейтрализации инфекционное™ не обязательно связаны с одним и тем же типом моноклональных антител, но способность защищать мышей от смертельной инфекции флавивирусами обнаружена только у нейтрализующих антител [440]. Различные белки одного и того же вируса различаются по антигенной активности, например, гликопротеин HN вируса парагриппа-3 вызывал более выраженный гуморальный ответ, чем гликопротеин F. При некоторых вирусных
инфекциях иммунитет связан, главным образом, с сенсибилизированными ци- тотоксическими Т-лимфоцитами. Мишенями для таких клеток чаще всего являются вирионные гликопротеины, а также ранние неструктурные белки, экспрессируемые на поверхности инфицированных клеток. Иммунизация неструктурным белком вызывала развитие протективного иммунитета [1566].
Гликопротеины обол очечных вирусов выполняют ряд важных функций в инфекционном процессе. Они определяют клеточный тропизм (прикрепление к чувствительным клеткам), слияние вирусной и клеточной мембран (проникновение в клетку вирусного генома), участвуют в сборке и почковании дочерних вирионов и, наконец, являются основными детерминантами иммунного ответа в случае инфицирования или вакцинации. Взаимодействие между компонентами иммунной системы и вирусными гликопротеинами сложное и является, скорее всего, определяющим фактором исхода инфекции. Формируя пепломеры на поверхности оболочечных вирусов, гликопротеины являются важнейшими, если не единственными антигенами вирионов, отвечающими за образование нейтрализующих антител. А так как гуморальный иммунитет при инфекциях, вызываемых оболочечными вирусами, как правило, является решающим фактором невосприимчивости, их роли придается большое значение. Информация о поли- пептидном скелете гликопротеинов закодирована в вирусных генах. Эти белки после синтеза экстенсивно гликозилируются клеточными ферментами (глико- зилтрансферазами). Композицию углеводных остатков контролируют как клетки хозяина так и вирусный белок, т. е., в конечном счете, вирус. Гликопротеины, в отличие от внутренних белков оболочечных вирусов, обогащены Cys-остатка- ми, обусловливающими образование дисульфидных мостиков и стабилизацию конформационной структуры.
Гликопротеины оболочечных вирусов относятся к обширному классу так называемых трансмембранных белков эукариот, объединяемых на основе формального признака специфической асимметрической ориентации, при которой часть молекулы погружена в липидный биослой [17]. В структуре вирусных гликопротеинов различают три домена: экто-, трансмембранный и цитоплазматический. Большая часть молекул гликопротеина (примерно около 90% длины, N-концевая область) формирует пепломеры, расположенные на внешней стороне билипидного слоя (эктодомен). Небольшая часть молекулы (С-конец) расположена под липидным слоем и взаимодействует с нуклеокапсидом (цитоплазматический домен).
Часть молекулы, примыкающая к С-концу и представленная приблизительно 20-25 гидрофобными аминокислотами, пронизывает липидный бислой и обеспечивает якорный эффект (трансмембранный домен). Различные структурные домены обладают специфическими функциями. Эктодомен связан с рецепторной и фузогенной функциями, с взаимодействием субъединиц и антител, нейтрализацией вируса. Трансмембранный домен обеспечивает взаимодействие с мембраной, а цитоплазматический — с нуклеокапсидом. Такова структура и организация гемагглютинина вируса гриппа, гликопротеинов G-вирусов везику
лярного стоматита, бешенства, обоих гликопротеинов альфавирусов, гликопротеина В-вируса герпеса и многих других вирусных белков. Однако имеются исключения из общего правила, например, полипептиды нейраминидазы вируса гриппа и белок HN парамиксовирусов «заякориваются» в липидном бислое N-концевыми (также короткими) доменами. Кроме того, в эту модель также не вписываются такие белки, как EI коронавирусов и интенсивно О-гликозилиро- ванные гликопротеины.
Относительно роли углеводного компонента в антигенности и иммуноген- ности вирусных гликопротеинов нет единого мнения. Гликопротеины S и М вируса леса Семлики как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах равным образом защищали мышей от летальной инфекции при последующем заражении вирулентным штаммом гомологичного вируса. Дегликозили- рование gpl герпесвируса типа 1 КРС сказывалось отрицательным образом на его антигенной активности, тогда как дегликозилирование gpIV того же вируса существенно не влияло на способность индуцировать синтез ВН-антител и антителозависимую цититоксичность [1572]. Корректное гликозилирование рекомбинантного белка Е1 вируса краснухи не являлось непременным условием его антигенности. Введение такого антигена кроликам вызывало образование нейтрализующих антител, которые не подавляли гемагглютинацию вируса [1513]. Рекомбинантный аналог gpl20 вируса иммунодефицита человека, экспрессированный в Е. coli, не содержал углеводов, но индуцировал синтез антител, подавляющих репликацию гомологичного штамма вируса. Из этих данных следует, что гликозилирование этого белка не является необходимым для протективного иммунного ответа [292]. В опытах с коронавирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней не установлено разницы в индукции ВН-антител и выраженности протективного иммунитета при использовании вируса с выраженной ГА-активнос- тью и без нее, полученного в результате репродукции в различных клеточных системах. Возможно, что первичное (котрансляционное) гликозилирование вносит больший вклад в формирование конформационных антигенных сайтов гликопротеинов, чем вторичное гликозилирование [576].
Система репродукции оказывает различное влияние на антигенные и имму- ногенные свойства вирусов. В одних случаях она имеет критическое значение, в других — популяция изменяется постепенно и практически без значительного изменения антигенной структуры, особенно в течение относительно короткого периода пассирования in vitro. Примером этого может служить вирус гриппа, иммуногенность которого снижалась при размножении в куриных эмбрионах по сравнению с культурой клеток млекопитающих (линия MDCK) в течение нескольких пассажей. Различия в популяции вируса, обусловленные хозяинной системой, заключались в замене двух аминокислотных остатков в молекуле ге- магглютинина [1313]. Такие изменения могут сопровождаться потерей сайта гликозилирования [51]. При репликации различных РНК-содержащих вирусов (пикорна-, альфа-, флави-, ротавирусов и др.) синтезируются высокомолекулярные вирионные полипротеины, которые подвергаются посттрансляционному
процессингу (расщеплению) вирусспецифическими протеазами, кодируемыми вирусным геномом или предсуществующими в клетках [1632]. Например, при репликации пикорнавирусов сначала образуется один белок (полипротеин), который затем расщепляется на четыре вирионных полипептида VP1-VP4. Основным индуктором синтеза вируснейтрализующих антител является VP1. В процессе естественной инфекции и после оральной вакцинации живой вакциной полиовирус подвергается воздействию протеолитических ферментов кишечника, в результате чего могут изменяться его антигенные свойства. Поэтому может оказаться целесообразным изготовлять инактивированную полиовакцину из вируса, обработанного трипсином [1322]. Протеолитическая активизация сопровождается значительным усилением репликации реовируса I [305] и повышением инфекционности вирусов оспы. Исследования, проведенные с вирусом оспо- вакцины, показали, что это связано с модификацией трех белков (54, 34 и 17—25 кД) поверхности вириона, которые вместе с двумя другими поверхностными полипептидами (29 и 32 кД) ответственны за нейтрализацию вируса. Расщепление наружного капсидного белка VP2 вируса катаральной лихорадки овец сопровождалось образованием однокапсидных частиц с высокой инфекционно- стью, но утратившим гемагглютинирующую активность [1061]. Протеолитичес- кое расщепление gpl 20 (остатки аминокислот 315—316) является необходимым процессом для проявления инфекционности ВИЧ-1. Имеются данные, свидетельствующие об активизации вирусных фузогенных гликопротеинов клеточными протеазами. Для первичной индукции вирусспецифических Тц лимфоцитов необходима протеолитическая активизация гликопротеина F, хотя этого не требовалось для индукции синтеза антител [1532].
Все вирусы гриппа млекопитающих и большинство птичьих штаммов репродуцируются в куриных эмбрионах в основном в неинфекционной форме с нерас- щепленной молекулой ГА. После обработки их in vitro бактериальными протеазами или трипсином значительно повышалась инфекционность. Структура вирусных белков в участке расщепления и наличие подходящей протеазы играют существенную роль в тканевом тропизме, репликации и распространении вируса в организме, то есть инфекционности и патогенезе [305], а также в иммуногенезе.
Протеолитическое расщепление in vitro может происходить не только внутри клетки, но и на ее поверхности или вне ее за счет плазмина сыворотки питательной среды либо искусственно внесенным в среду трипсином. НА вируса гриппа может расщепляться обоими путями. В первом случае, удаляемый при разрезании соединительный пептид содержит до пяти остатков основных аминокислот, во втором, — один или два. Расщепление НА вируса гриппа сопровождается трансконформацией и, вероятно, изменением антигенных свойств. Расщепление белка F вируса Сендай также сопровождается конформационными изменениями, приводящими к повышению его гидрофобное™ [25]. Таким образом, регулируемый ограниченный протеолиз полипептидов-предшественни- ков — один из основных процессов в формировании биологически активных структурных белков многих вирусов.
Топографическое и функциональное картирование наиболее важных антигенных участков вирусных белков, ответственных за иммунологическую специфичность и особенно за индукцию протективного иммунитета, представляет исключительно важное значение для конструирования современных средств специфической профилактики вирусных инфекций.
Наряду с общими представлениями о вирусных антигенах накоплены сведения, характеризующие индивидуальные особенности различных антигенов многих конкретных вирусов, знание которых важно как для лучшего понимания па- то- и иммуногенеза при отдельных заболеваниях, так и для разработки вакцинных препаратов.
При изготовлении культуральных вакцин существует потенциальная проблема селекции антигенных вариантов вируса. Фенотипическая модификация вирусной популяции, ведущая к изменению антигенных свойств, может возникать и требовать постоянного контроля антигенности в процессе производства.