Установлено, что для разных вирусов требуется разная продолжительность аттенуации. Примером короткого периода аттенуации могут служить вирусы чумы уток и ринотрахеита индеек. Для аттенуации первого требовалось примерно 20 пассажей в первичной культуре клеток куриного эмбриона, второго — 17 пассажей в культуре клеток Vero [ 1663]. Оба полностью авирулентных штамма обладали выраженной иммуногенностью и вызывали резистентность у привитых животных вскоре после однократного парентерального введения. В этом отношении они напоминали высокоиммуногенные живые вакцины против ряда других заболеваний животных.
Высокоэффективные и безопасные вакцинные штаммы чаще и быстрее удавалось получить у оболочечных вирусов, чем у безоболочечных. Тип геномной нуклеиновой кислоты, казалось, не имел значения.
Кроме обычного серийного культивирования, для ускорения аттенуации вирусов использовали метод быстрых пассажей, суть которого заключается в следующем. Уже на ранних этапах аттенуации в популяции вируса появляются новые мутанты, отличающиеся более быстрым размножением в новой системе и аттенуированным фенотипом. Если, применять большую заражающую дозу и собирать «ранний» урожай вируса для очередного пассажа, то можно значительно ускорить процесс аттенуации. В опытах с вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей, например, было установлено, что популяция вируса, размноженного в клетках ВНК, содержит две группы клонов: медленно проникающие в клетки и вирулентные; быстро проникающие в клетки и авирулентные [857].
Используя данный принцип, был получен аттенуированныи штамм А-14-2 для живой вакцины против японского энцефалита. Стабильная аттенуация вируса наступила после 23 быстрых пассажей в первичной культуре клеток почки хомяка [1614].
Недостатками живых вакцин являются:

1. потеря аттенуации вакцинным штаммом (реверсия или компенсаторная мутация);
2. возможность содержания посторонних агентов (контаминация);
3. горизонтальное (контактное) распространение;
4. длительная персистенция в привитом организме.

Основным недостатком является возможность восстановления вирулентности вакцинным вирусом вследствие размножения в организме естественного хозяина. Реверсию фенотипической экспрессии мутаций обычно отмечают у вакцинных штаммов, аттенуированных единичными точечными мутациями. Реверсия некоторых из аттенуированных точечных мутантов обнаружена в процессе репликации in vivo даже через 47 часов после вакцинации [1130]. Реверсия вирулентности за счет обратных точечных мутаций была отмечена у аттенуированных штаммов вирусов бешенства и полиомиелита [716]. В подобных случаях реверсия вирулентности может произойти не только за счет обратной мутации «поврежденных» нуклеотидов (нуклеотида), но также за счет супрессорных мутаций в тех же самых генах или в других генах, которые ведут к восстановлению исходного фенотипа [511].
Множественные точечные мутации и особенно делеции делают практически невозможной реверсию вирулентности вакцинного штамма в процессе его применения.
Реверсибельность вакцинных штаммов привлекает внимание при внедрении новых живых вакцин. Реверсия лицензированных вакцин не является проблемой их практического применения, хотя она существует теоритически. При массовом применении таких вакцин, если реверсия происходит, то происходит исключительно в редких случаях и остается, как правило, незамеченной.
И все таки, если случайная единичная реверсия состоялась, то вирулентный вирус вначале должен преодолеть резистентность привитого организма, обусловленную данной вакциной, а затем найти восприимчивые особи среди привитых для своего распространения. Однако к этому времени основной контингент вакцинированных станет иммунным. Действительно, при использовании живых вакцин в практических условиях еще не зарегистрировано случаев распространения заболевания в результате реверсии вакцинного штамма вируса, если он был надежно аттенуирован [44, 1131].
Так как пока отсутствуют надежные лабораторные маркеры дифференциации вирулентного и аттенуированного штаммов вируса, используют другие методы. Реверсибельность вакцинных штаммов, используемых для изготовления живых вакцин, применяемых в ветеринарии, проверяют на естественно восприимчивых животных. Аттенуированные штаммы, не усилившие реактогенность и не восстановившие вирулентность в течение пяти последовательных пассажей на наиболее чувствительном к естественной инфекции виде животных, считаются пригодными для изготовления живой вакцины. Проверка реверсибельности вакцинных штаммов вирусов человека более затруднительна. Для оценки аттенуации вирусных штаммов используют генотипические и фенотипические мар
керы, кроме того надежность аттенуации вирусных штаммов, предназначенных для вакцинации людей, проверяют на экспериментальных животных, и в первую очередь на обезьянах. Идентификация вакцинных штаммов против различных вирусных болезней человека, и в первую очередь против желтой лихорадки и полиомиелита, стала возможной с помощью таких животных.
Установлена возможность реверсии вакцинного штамма при серийном пассировании в культуре элективных клеток хозяина. Так например, аттенуированный штамм Рокборн вируса чумы плотоядных давал реверсию как при серийном пассировании на собаках, так и в культуре легочных макрофагов собак [248].
Горизонтальная передача и длительное носительство вакцинного штамма вируса считаются нежелательными явлениями.
При лицензировании новых живых вакцин для животных во многих странах (ЕС, США, Япония) их проверяют на отсутствие горизонтальной передачи вакцинного штамма. Проверку проводят на естественно восприимчивых животных (10 вакцинированных и 10 контактных). При совместном содержании в течение 2—4 недель о наличии или отсутствии горизонтальной передачи судят по результатам тщательного лабораторного обследования этих животных. Однако при отрицательном результате таких исследований не исключается принципиальная возможность контактной передачи вакцинного штамма при массовой вакцинации в условиях влияния множества эндогенных и экзогенных факторов. Редкие случаи такой передачи некоторых вакцинных штаммов известны, но они не ведут к повышению вирулентности вакцинного вируса и не сопровождаются снижением эффективности вакцинации. Исключением из этого правила является живая вакцина против полиомиелита. Вакцинный штамм Сэбина полиовируса типа 1 и 3 в редких случаях оказался способным вновь обрести нейровирулентность и вызывать заболевание у вакцинированных или у контактировавших с ними людей. Однако это происходит с исключительно низкой частотой (около одного случая на 106—107 иммунизаций) и в общем не влияет на выраженную эпидемиологическую эффективность данного препарата [1131]. Выяснена генетическая основа этого довольно редкого повышения вирулентности полиови- русных вакцинных штаммов при репликации в кишечнике привитых.
Другое исключение состоит в том, что некоторые аттенуированные вакцинные штаммы могут довольно легко передаваться горизонтальным путем, не вызывая при этом нежелательных последствий. Однако из-за их высокой эффективности приходится мириться с циркуляцией вакцинного вируса в популяции. Таким примером могут служить некоторые вакцинные штаммы вируса ньюкаслской болезни, которые бессимптомно иммунизируют кур, находящихся в контакте с привитыми в полевых условиях [1366]. Способность некоторых аттенуированных штаммов выделяться из организма вакцинированных животных и иммунизировать контактирующих индивидуумов данной популяции считалась положительным явлением, так как облегчала формирование группового иммунитета. Вероятно, данное положение может быть приемлемым только в случае применения нереверсибельных вакцин.
Другая потенциальная опасность живых вакцин состоит в том, что вакцинные штаммы могут длительно персистировать в организме привитых. Например, известны случаи, когда вирус краснухи выделяли из лимфоцитов лиц с артритами через 6 лет после иммунизации [ИЗО]. Известны также случаи длительной персистенции (19 мес) вакцинного штамма вируса ветряной оспы в организме привитых детей с последующей реактивацией и восстановлением вирулентности [701]. Однако, в общем, вероятность такой ситуации очень низкая, а широкое применение живой вакцины против кори устраняет редкое, но длительное носи- тельство полевого вируса кори [1131].
Живые вакцины, применяемые в ветеринарии, должны использоваться только для тех видов животных, для которых они предназначены. Например, живая вакцина против чумы собак может вызывать летальную инфекцию у некоторых видов пушных зверей. Живая вакцина против болезни Ауески безопасна для свиней, но высоко вирулентна для пушных зверей.
Противоположным явлением недостаточной аттенуации является чрезмерная аттенуация вируса, при которой могут утрачиваться полезные свойства аттенуированных штаммов и практический смысл их получения. Чрезмерная аттенуация вируса кори при длительном пассировании в различных культурах клеток могла быть возможной причиной ослабления иммуногенной активности вакцины Эдмонстон-Загреб и Ленинград-16 [1420]. Однако такого не произошло в опытах с вирусом осповакцины. После продолжительной персистентной инфекции выделены аттенуированные для мышей мутанты, имеющие большую делению размером 8 МД на левом конце генома и изменение нуклеотидной последовательности в другой части генома, что сопровождалось значительным изменением структуры белков оболочки (14 и 21 кД) и нуклеоида (39 кД). Несмотря на такие изменения, аттенуированные мутанты сохраняли иммуногенность и защищали мышей от заражения летальными дозами вирулентного штамма вируса. Таким образом, глубокая аттенуация вируса осповакцины сохранялась в процессе персистенции и, несмотря на значительные изменения генома и поверхностных белков, не сопровождалась потерей иммуногенных свойств [559]. Создается впечатление, что вирус осповакцины является исключением из правил.
Во избежание потери полезных свойств при изготовлении живых вакцин используют вакцинные штаммы только в том диапазоне пассажей, который определен для каждого из них в предварительных опытах и является гарантией безвредности и активности вакцины (обычно в течение не более 20 пассажей от матричной расплодки вируса).
Теоретически одновременное введение двух или более живых вакцин может вызывать снижение иммунного ответа за счет гетерологической интерференции вакцинных штаммов вирусов. На практике оказалось, что это зависит от конкретных вакцин. Так, одновременное применение комбинированной вакцины против кори, краснухи и паротита безопасно и эффективно [ 1000]. Аналогичный результат получен при одновременной иммунизации кур против болезни Марека, ларинготрахеита, ньюкаслской болезни и оспы. Однако пероральная вакци
на против полиомиелита и вакцина против ротавирусной инфекции не сочеталась между собой. Также не рекомендуется использовать комбинацию живых вакцин против инфекционного бронхита, ларинготрахеита и ньюкаслской болезни. Вероятно, все зависит от места репликации вакцинных вирусов в организме. Если места репликации вакцинных штаммов совпадают, значит будет гетероинтерференция, и такие вакцины нельзя применять одновременно.
В некоторых случаях, встречающиеся в природе «дикие» вирусы могут угнетать репликацию вакцинного вируса и снижать эффективность вакцинации. Это впервые было отмечено у вакцинных штаммов полиовируса, репликация которых в кишечнике подавлялась конкурентно инфицированием другими энтеровирусами [169].
Вакцинация живыми вакцинами может сопровождаться рекомбинацией между вакцинными и полевыми штаммами или между вакцинными штаммами [767, 914]. Возможность рекомбинации вакцинных штаммов обнаружена у вирусов разных семейств.
В случае одновременной вакцинации двумя различными аттенуированными штаммами с делециями в двух комплементарных генах потомство рекомбинантного вируса может полностью восстановить вирулентность, как это имело место в случае с вакцинацией против болезни Ауески [872].
Рекомбинация встречается главным образом у ДНК-вирусов, но может иметь место и у РНК-вирусов. Например, установлена рекомбинация между тремя серотипами вакцинных штаммов Сэбина полиовируса, изолированных из кишечника вакцинированных; некоторые рекомбинанты содержали последовательности трех серотипов [1286]. При одновременном введении двух авирулентных штамов ВПГ-1 образуются вирулентные рекомбинанты, вызывающие летальную инфекцию у мышей [847]. Вирулентные рекомбинанты получены из авирулентных штаммов аденовируса. Аналогичные рекомбинанты образовывались в организме овец при одновременном введении им нескольких аттенуированных штаммов различных серотипов вируса катаральной лихорадки овец. Подобное явление отмечено в опытах с ротавирусами. Внезапное возникновение цитопатогенного штамма вируса диареи КРС из пула нецитопатогенного штамма также обусловлено рекомбинацией. Возможность рекомбинации между полевым вирусом и аттенуированным штаммом вируса обычно незначительна, т.к. для этого необходимо, чтобы оба вируса размножались одновременно, в одних и тех же клетках одного животного [379, 12161. В случае массовой профилактической вакцинации риск такой рекомбинации возрастает. Эти данные свидетельствуют о том, что молекулярная природа аттенуации разных штаммов (серотипов) одного и того же возбудителя может быть различной.
Живые вакцины могут быть загрязнены посторонними вирусами, попадающими в них вместе с биологическими субстратами, используемыми при изготовлении вакцины. Ранним примером, оставившим международный след в истории вакцинации, был занос вируса ящура в США в 1908 г. в качестве контаминанта с вирусом осповакцины, размноженным на телятах [ 1135]. В живых вакцинах, по
лучаемых на куриных эмбрионах, может присутствовать вирус лейкоза птиц. Известны случаи контаминации вакцины против болезни Марека вирусами ре- тикулоэндотелиоза и аденовирусной инфекции кур. Некоторые контаминирую- щие вирусы могут обладать онкогенным действием, то есть вызывать неоплазию. Одним из них является полиомавирус обезьян SV-40, вызывающий развитие опухоли у некоторых видов лабораторных животных. Контаминация этим вирусом некоторых ранних серий инактивированной вакцины против полиомиелита была выявлена ретроспективно. К счастью, спустя длительное время у новорожденных и подростков, получивших парентерально контаминированную SV-40 вакцину, не удалось обнаружить видимого онкогенного эффекта [1131]. Особенно опасно загрязнение вакцин вирусами медленных инфекций, поскольку заболевание может проявляться спустя длительное время после вакцинации, а убедительно показать связь их с вакциной другим способом довольно трудно.
В качестве контаминантов живых вакцинных препаратов, применяемых в животноводстве, были обнаружены вирусы синего языка овец [225, 1659], пограничной болезни овец [978], лейкоза КРС [1319], диареи КРС [1639], ретикулоэн- дотелиоза птиц [1711]. Особенно часто живые вакцины загрязняются вирусом диареи КРС [1151].
Чтобы избежать контаминации живой вакцины RBOK против чумы КРС вирусом диареи (ВД), часто присутствующим в сыворотке крови, используемой при культивировании, вакцинный штамм размножают в культуре клеток Vero, непермиссивной для ВД [1008]. С целью предотвращения контаминации этим и другим вирусами сыворотку КРС перед использованием рекомендуется стерилизовать гамма-лучами.
Стабильность живых вакцин при длительном хранении - серьезная проблема, особенно в работе с лабильными вакцинными вирусами, такими как вирус болезни Марека, вирус кори и другие парамиксовирусы. Необходимость хранения и транспортировки таких вакцин при нужной температуре затрудняет их применение в некоторых южных регионах, где поддержание «Холодовой цепи» связано с определенными трудностями.
Проблема в известной мере решается добавлением стабилизирующих агентов к вакцине, селекцией термостабильных вакцинных штаммов и оптимизацией режима лиофилизации [1008, 1009].