Увеличение продукции вируса представляет собой большой практический интерес, особенно при массовом производстве вирусных препаратов. Изучению влияния различных факторов на репродукцию вирусов и накопление вирусных антигенов в культуре клеток посвящены многие исследования. Оказалось, что это зависит от ряда условий, оптимизация которых имеет важное технологическое значение.
Успех культивирования вирусов прежде всего зависит от удачного выбора клеточного субстрата. Основными критериями при этом являются высокий выход вируса и вирусного антигена, относительная неприхотливость к условиям культивирования и безопасность вакцины. Одни вирусы хорошо размножаются
в культурах клеток различного происхождения, другие - предпочитают клетки естественного хозяина или дифференцированные, либо требуют специфических условий культивирования (пониженную температуру, обработку трипсином, высокую или низкую множественность заражения), третьи — вообще пока не удалось размножить вне организма. При культивировании вирусов выявлен ряд особенностей, характерных для отдельных семейств и их представителей. Так, большинство пикорнавирусов, так же как и парвовирусов размножаются в культурах клеток естественного хозяина. Основная трудность в работе с ними — выбор чувствительной культуральной системы. Однако даже при оптимальном решении этой задачи, урожай различных представителей семейства пикорнавирусов различается очень сильно. Одни из них (полиовирус, вирус ящура) накапливаются в высоком титре (7,0—9,0 ТЦД50/мл), что соответствует выходу, примерно равному 10—1000 инфекционных единиц на одну клетку. В то же время другие представители семейства (риновирусы, некоторые энтеровирусы, вирус гепатита А) накапливаются в более низком титре (4,0—6,0 lg ТЦД50/мл). Вирус гепатита А хорошо размножается в культуре клеток печени обезьяны, а вирус гепатита В впервые in vitro удалось размножить в культуре клеток гепатомы человека HepG = 2. В культуральную жидкость выделялись полные частицы вируса, содержащие три оболочечных белка. Рабдовирусы обладают широким хозя- инным спектром in vitro. Вирус везикулярного стоматита, например, хорошо и быстро размножается практически во всех использованных для этой цели клеточных культурах, хотя некоторые представители этого семейства (вирус бешенства) размножаются медленно и накапливаются в меньшем титре.
Представители семейства парамиксовирусов значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра клеточных культур. Одни из них (парамиксовирусы) обладают широким, другие (морбилливирусы) — узким хозяин- ным спектром. Респираторно-синцитиальный вирус (PC-вирус), как и другие представители семейства, размножается во многих клеточных культурах (но не в культуре куриного эмбриона), хотя накапливается в значительно более низких титрах. Например, разница в максимальном накоплении инфекционных частиц, если сравнить его с вирусом ньюкаслской болезни, достигает 5—6 lg. Вместе с тем следует отметить, что соотношение инфекционных и физических частиц у PC-вируса может достигать высоких значений (1:1000—1:10 000) [94]. Вирус диареи крупного рогатого скота обладает узким клеточным тропизмом и, так же как PC-вирус, накапливается в чувствительных культурах в невысоком титре (4,0—6,0 lg ТЦД50/мл). Первичная культура клеток почки телят оказалась более чувствительной к полевым изолятам вируса диареи, чем постоянная линия этих клеток [977]. Реовирусы размножаются в культурах клеток различного происхождения, но лучше, когда выращивание проводят при пониженной температуре (34°С). Однако представители одного рода этого семейства (ротавирусы) проявляют исключительную щепетильность в отношении клеточного субстрата. Одна из лучших культур для выделения и размножения ротавирусов — постоянная линия клеток почки эмбриона макаки резус (линия МА 104). Для аденовирусов
предпочтительным субстратом являются культуры эпителиальных клеток естественного хозяина. В эпителиоподобных клетках постоянных линий HeLa и КВ они накапливаются в более высоком титре, чем в диплоидных линиях фибробла- стоподобных клеток (WI-38 или MRC-5).
Культуры клеток беспозвоночных по сравнению с позвоночными во многих случаях оказались более продуктивными в отношении альфа- и флавивирусов.
Первичные культуры клеток, приготовленные из различных тканей одного вида животных или даже одного донора клеток, могут значительно различаться по чувствительности к данному вирусу. Большинство вирусов хорошо накапливаются в культуре клеток паренхиматозных органов, тогда как некоторые предпочитают клетки гемопоэтической системы (лимфопролиферативные вирусы, вирусы африканской чумы свиней, инфекционной анемии лошадей) или нервной ткани. Наиболее широким спектром чувствительности обладают первичные культуры, представленные преимущественно эпителиоподобными клетками. Такие культуры, как правило, получают из почечной ткани различных животных. Аденовирусы свиней серотипа 2 и 3 хорошо размножались в первичной культуре клеток почки (6,25—8,0 lg ТЦЦ50/мл), и значительно хуже в первичной культуре клеток тестикулярной ткани поросят [782]. Для вируса контагиозной эктимы овец и коз более чувствительной оказалась культура тестикулярной ткани овец и коз [1030]. Аналогичные результаты получены в опытах с вирусом вис- на-мэди. Вирус энцефаломиелита свиней размножается в культуре клеток почки свиньи с образованием синцития. В культурах клеток из других тканей свиньи вирус размножается без ЦПЭ.
Разработаны методы получения эпителиоподобных культур клеток из хорио- аллантоисной оболочки куриных эмбрионов. Они оказались более чувствительными и продуктивными для ряда вирусов, чем культуры фибробласто-подобных клеток из тканей куриного эмбриона. Например, клетки хориоаллантоисной оболочки более репродуктивны для вируса ньюкаслской болезни, чем клетки тела куриного эмбриона. Кроме того, клетки одной и той же ткани могут сильно отличаться друг от друга по репродукции вируса. Исследование репродукции вируса ньюкаслской болезни единичными клетками куриного эмбриона показало, что из числа продуцирующих вирус клеток только 20% синтезируют инфекционный вирус в большом количестве. Указанное соотношение клеток сохранялось в культуре из различных тканей эмбриона в течение трех пересевов.
В первичной культуре клеток почки эмбриона человека способностью поддерживать репродукцию цитомегаловируса человека обладают клетки, которые, вероятно, являются клетками-мишенями в организме хозяина [766]. Культуры клеток астроцитов из мозга плода человека обеспечивают размножение нейрот- ропного полиомавируса человека JCV и могут быть многократно пассированы без потери фенотипа астроцитов и снижения чувствительности к вирусу. Для реактивации вируса простого герпеса 1 (ВПГ-1) использовали эксплантаты кожи и подкожной ткани подушечек задних лап мышей, взятых через 6 мес после инфицирования. В процессе культивирования эксплантатов происходила реактива
ция вируса. Фокусы реактивации латентного вируса обнаруживали гибридизацией in situ, начиная с 5—6-го дня. По мере культивирования количество клеток и содержание в них вирусспецифических нуклеиновых кислот возрастали [504].
Культуры гепатоцитов, являясь элективным субстратом для размножения вирусов, вызывающих гепатиты, оказались чувствительными к другим вирусам. Так, в культуре клеток печени эмбриона кур хорошо размножались некоторые вирусы кур: инфекционного ларинготрахеита, бронхита, бурсита, ЕД5 и CELO. Первичные культуры гепатоцитов лесного северо-американского сурка оказались чувствительными к инфицированию вирусами гепатита сурка и суслика [221], а культуры гепатоцитов пекинских уток — к вирусу утиного гепатита В. Ге- патоциты печени сурка, полученные перфузией раствором коллагеназы, формируют монослой, сохраняющийся в течение 3 мес. [486].
Постоянные линии клеток, так же как первичные культуры, обладают различной чувствительностью к вирусам. Выбор наиболее чувствительного клеточного субстрата проводят на основе литературных данных или экспериментальным путем. Одни линии клеток являются хорошим субстратом для репродукции целого ряда вирусов. К ним прежде всего следует отнести постоянную линию клеток ВНК, высокочувствительную к таким возбудителям, как вирусы ящура, бешенства, катаральной лихорадки овец, болезни Ауески и др. Широкое применение для производственного культивирования вирусов получили постоянные линии клеток обезьян (Vero), свиней (СПЭВ, ППС, IBRS-2), крупного рогатого скота (МДВК) и других видов животных. Вирус бешенства, адаптированный к размножению в культурах клеток ВНК-21 и Vero, через 24 ч инфицировал практически все клетки, однако в продуктивную инфекцию включалось лишь около 10 % клеток обеих линий. На пятые сутки концентрация вируса достигала 7,2 lg ТЦД50/мл или ЛД59/мл (для 3—5-недельных мышей). Линия клеток легких хомяка HmLu-1 оказалась чувствительной для репликации вирусов эфемерной лихорадки, Ибараки и Акабане. Указанные вирусы размножались в этой культуре с выраженным ЦПЭ через 48—72 ч. Вирусы парагриппа человека типов 2 и 3 размножались с ЦПЭ в постоянной линии клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1, достигая через 48—72 ч титра 7,0 lg БОЕ/мл.
Вирус гепатита В уток удалось размножить в линии клеток LMH гепатомы цыпленка. В этой линии клеток выход инфекционного вируса в 10—20 раз был выше, чем в линиях клеток гепатомы или гепатобластомы человека. Линия клеток рабдомиосаркомы человека (клон ЯД-9Н8) эффективно поддерживала размножение респираторного коронавируса человека. Из-за строгого тропизма парвовируса В19 к эритроидным клеткам-предшественникам его размножали лишь в эксплантатах костного мозга и печени плода человека. Его удалось размножить в линии клеток ИТ-7, полученной от больного мегакариоцитобласто- идной лейкемией [1410]. Высокое накопление вирулентного штамма вируса классической чумы свиней (8,0 lg ТЦЦ50/мл) наблюдали в статической культуре постоянной линии клеток почек свиньи (линия МРК). Вирус достигал высокого титра через 72 ч культивирования.
Полевой изолят вируса оспы овец адаптировали к постоянной линии клеток почек овцы. В первом пассаже вирус вызывал очаговый ЦПЭ на 6-7-й день, а в четвертом пассаже - выраженный ЦПЭ через 5-7 дней.
Постоянные линии клеток оказались эффективными культуральными системами для репродукции кишечных вирусов, клетками-мишенями для которых in vivo являются в основном эпителиальные клетки апикальной области ворсинок тонкого отдела кишечника. Сказанное прежде всего относится к рота-, корона- и астровирусам человека, а также животных.
Линия клеток карциномы прямой кишки человека (НТ-29) оказалась высокочувствительной системой для выращивания ротавирусов, особенно человека [1474]. К астровирусам человека оказалась чувствительной постоянная линия клеток СаС02, выведенная из карциномы толстого отдела кишечника человека [1662].
Изучали чувствительность различных линий клеток свиного происхождения к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС). Все девять изученных штаммов вируса ТГС хорошо размножались в линии клеток СРК и первичной культуре клеток почки поросят. Пять штаммов размножались с ЦПЭ в линии клеток IBRS-2. Ни один из штаммов не вызывал ЦПЭ в линиях клеток FSK и РК-15. Однако шесть штаммов приобрели способность размножаться и вызывать ЦПЭ после пассажа в клетках СРК. Трипсин оказывал стимулирующее действие на размножение вируса ТГС [798].
При изготовлении вакцин, предназначенных для человека, наиболее часто используют линии диплоидных клеток WI-38 и MRC-5.
Культуры диплоидных клеток тестикулярной ткани ягнят используют в производстве живой вакцины против классической чумы свиней, а тканей легкого эмбриона крупного рогатого скота — для размножения вакцинных штаммов, вирусов чумы крупного рогатого скота и оспы овец. Полевой изолят вируса геморрагической болезни кроликов размножался в штамме клеток почки кролика (DJRK), вызывая ЦПЭ после двух пассажей.
Для выделения и репродукции некоторых вирусов используют специальные линии клеток. Например, для вирусов диареи и ринотрахеита крупного рогатого скота высокочувствительными оказались линии клеток слизистой оболочки носа крупного рогатого скота и легких норок, для многих вирусов свиней — гомологичные линии клеток, а для ротавирусов — линия клеток обезьян (МА-104). Постоянные линии клеток, полученные из одних и тех же тканей одного вида животного, так же как их сублинии (клеточные клоны), могут значительно различаться между собой спектром чувствительности и вирусной репродукцией.
Продукция вируса лейкоза крупного рогатого скота в хронически инфицированных однослойной и суспензионной культурах в зависимости от используемой сублинии клеток FLK (foetal lamb kidney) может различаться в 10 раз. Клонированные сублинии клеток ВНК-21 значительно различались между собой чувствительностью к некоторым типам и штаммам вируса ящура. В суспензионной культуре клеток ВНК-21 по мере длительного пассирования (200 пассажей)
наблюдается снижение выхода вируса ящура вследствие нарушения морфогенеза на стадии прокапсида [779]. Адаптированные к размножению вне организма штаммы вируса размножаются в культурах, как правило, быстрее и с большим выходом, чем неадаптированные «дикие» штаммы. Лучше всего размножаются штаммы, адаптированные к данной культуре, хотя их размножению часто способствует первоначальная адаптация к другим клеточным культурам. Многие вирусы, элективной системой для которых являются культуры клеток гемопоэ- тической системы естественного хозяина, хорошо размножаются в них без адаптации. При адаптации вирусов, размножающихся медленно и не вызывающих или вызывающих слабый ЦПЭ, целесообразно однослойные инфицированные культуры инкубировать длительно (2—4 недели) и использовать пересев инфицированных клеток. В качестве примера может служить вирус иммунодефицита кошек (штамм Петалюма), который вызывал ЦПЭ в культуре клеток кошачьей Т4-тимус-лимфомы 3101 через 22 дня после заражения [1525].
Адаптация некоторых вирусов и вирусных штаммов к размножению в культуре клеток — трудный процесс, который требует нетрадиционных подходов. Для адаптации вируса гриппа к новой хозяинной системе предложено использовать метод форсированных пассажей, при котором проводят серию одноцикловых репликаций вируса. Для серийных пассажей применяют «ранний» урожай вируса без разведения. Положительные результаты получали при сокультивировании инфицированных клеток и тех, к которым желательно адаптировать вирус. Способный к размножению в организме кроликов штамм L вируса чумы крупного рогатого скота адаптировали в культуре клеток \fero путем культивирования смеси лимфоцитов селезенки зараженного кролика и клеток Vero в присутствии ПЭГ. Внеклеточный вирус не обнаруживали в течение трех пассажей. К 11 пассажу вирус накапливался в титре 5,5 lg ТЦД50/мл и кроме клеток Vero приобрел способность размножаться в клеточных линиях ВНК-21, С-1, К-13 непермис- сивных для исходного штамма вируса [834]. Линия клеток (FLK — BLV), хронически инфицированная вирусом энзоотического лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), получена при сокультивировании клеток почки плода овцы и лимфоцитов крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС.
Вирус иммунодефицитоподобного заболевания крупного рогатого скота выделяли от естественно и экспериментально инфицированных телят сокультиви- рованием клеток крови с клетками селезенки плода коров [1182, 1647]. Индуцированное вирусом образование синцития реже наблюдали в культурах клеток почки и легкого плода коров [1182]. Вирус иммунодефицита кошек (FIV) удается выделить путем инокуляции периферической крови или спинномозговой жидкости больных животных в первичную культуру клеток глии, лимфоцитов или мононуклеарных клеток крови кошек. Цитопатический эффект наблюдали через 8—14 дней после сокультивации (клеточные агрегаты синцитий, цитоплазматические вакуоли).
При культивировании вне организма одни вирусы обладают широким хозя- инным спектром (герпес-, рабдовирусы), другие — узким (napBos коронавиру-
сы). В последнем случае адаптация вируса к некоторым культурам обычно принятыми методами не удается. Попытки адаптировать вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней к постоянной линии клеток почек поросят (линия LL С-PKI) оказались безуспешными в отличие от культуры клеток щитовидной железы свиньи.
При культивировании in vitro важное значение могут иметь изменения вирусов, обусловленные клетками хозяина. Вирус ньюкаслской болезни, пассируемый в первичной культуре клеток КЭ, по морфологии, плавучей плотности и устойчивости при градиентном центрифугировании значительно отличался от вируса, размноженного в КЭ.
При смене хозяина наиболее часто происходит маскирование антигенных сайтов в процессе гликозилирования. В молекуле гемагглютинина вирусов гриппа А и В выявлено около 30 сайтов гликозилирования, поэтому селекция различных биологических вариантов вируса, отличающихся от исходной популяции, неизбежна при каждой смене хозяина. Индуцируемые клетками хозяина различия в гликопротеинах отмечены у вируса простого герпеса [989]. В гликопротеинах ВГП-1, размноженного в культурах NBL L или Vero и ВНК-21, выявлены существенные количественные и качественные различия. Это дало основание заключить, что олигосахаридный процессинг гликопротеинов ВПГ-1 может варьировать в культурах клеток различных млекопитающих [229]. Кроме того, при серийном размножении в различных линиях клеток наблюдали дивергенцию дочерних популяций ВПГ-1 по меньшей мере по одному параметру (анти- генность, нейровирулентность, способность к латенции и реактивации) в результате селективного отбора [640]. Популяции вируса гриппа, адаптированные к размножению в постоянной линии клеток МДСК и на куриных эмбрионах, отличались между собой антигенными свойствами. Адаптация вируса гепатита А к культуре клеток сопровождается нуклеотидными делециями в гене, кодирующем белок VP1. После 60 пассажей в культуре клеток обнаружено 18 нуклеотидных делеций, обусловливающих замещение минимум шести аминокислот в белке [1314]. Заметное влияние на продукцию вирусов оказывает фаза роста клеток и возраст культур. Зависимость размножения от фазы роста клеток наиболее выражена у парвовирусов, которые в силу особенностей репликации размножаются эффективно лишь в культурах делящихся клеток. Для этого необходимы, по- видимому, средняя и поздняя стадия S-фазы клеточного цикла. При создании оптимальных условий удалось наблюдать образование бляшек парвовирусом свиней в постоянной линии клеток почки эмбриона свиньи. Вирус вносили во флаконы с культурой через 3 ч после высева клеток (400—600 тыс. в 1 мл) и спустя восемь дней инкубации наблюдали образование бляшек диаметром 0,5-3,5 мм. Максимальное количество бляшек появилось при адсорбции вируса в течение 90 мин и дозе вируса около 30 БОЕ в 0,2 мл. Добавление декстрана (50 мкг/мл) в среду покрытия способствовало образованию бляшек. Эклипсфа- за размножения парвовируса свиней составляла 8—10 ч. Экстрацеллюлярный вирус обнаруживали через 16 ч. Гемагглютинин появился через 10 ч, а вирусный ан
тиген в ядре и цитоплазме был выявлен МФА через 8—12 ч. В растущих культурах выход многих вирусов больше, чем в культурах в стационарной фазе роста. Например, в активной растущей культуре репродукция респираторно-синцитиального вируса возрастала в 20—60 раз по сравнению с выросшей, тогда как вирус парагриппа накапливался одинаково в обеих культурах. Продукция ВИЧ в неразмножающейся культуре с высокой плотностью популяции клеток (линия Molt-4) была значительно выше, чем в растущей с низкой плотностью.
Некоторую специфику представляют культуры дифференцирующихся клеток. Чувствительность лейкоцитов, претерпевающих бласттрансформацию в процессе выращивания, может изменяться в отношении некоторых вирусов. Например, лейкоциты телят через 5—7 дней культивирования оказались наиболее чувствительными к вирусу чумы крупного рогатого скота. Лейкоциты человека после культивирования приобретали чувствительность к вирусу ньюкаслской болезни, тогда как в свежевыделенных клетках вирус не размножался. Эндотелиальные клетки человека были пермиссивными для полиовируса человека после четырех суток культивирования, что во многом зависело от экспрессии полиови- русных рецепторов на клеточной поверхности [543]. Чувствительность полипо- тентных стволовых клеток костного мозга человека к парвовирусу В19 возрастает по мере их дифференциации в культуре [1482]. Однако первичная культура клеток гепатоцитов утят была компетентной к заражению вирусом гепатита В уток только в первые четыре дня культивирования. Для усиления репродукции вирусов в культурах гемопоэтических клеток прибегали к стимуляции бласттран- сформации. В качестве митогена чаще всего использовали фитогемагглютинин (ФГА), стимулирующий размножение некоторых вирусов в лейкоцитарных культурах [168]. Аналогичным действием обладал диметилсульфоксид в линии клеток лейкоцитов человека (HL-60), инфицированной вирусом гриппа, и в культуре клеток почки кролика (РИЗ), инфицированной вирусом ринотрахеита крупного рогатого скота. Накопление вируса в культуре может зависеть от особенностей клеточной сублинии, а также используемого вирусного штамма и степени его адаптации.
При инфицировании вирусом выросших культур часто используют поддерживающие питательные среды, отличающиеся от ростовых сред тем, что не содержат сыворотки или, кроме того, имеют более простой состав.
Кроме неорганических солей существенным компонентом для максимального накопления вируса является глюкоза.
Относительно влияния источников азотистого питания и других факторов на урожай вирусов имеются противоречивые сведения. Известно, что вирус может размножаться в клетках при полной остановке синтеза клеточных компонентов путем исключения необходимых субстратов из состава среды. Однако для максимального накопления вирусов в культуре могут требоваться различные органические добавки к солевому раствору.
Присутствие глютамина (0,03%) и глюкозы (0,2%) в сбалансированном солевом растворе обеспечивало высокое накопление вируса ящура в клетках ВНК-21
(108 БОЕ/мл), тогда как добавление сыворотки и других органических компонентов не увеличило выход вируса. Максимальный урожай полиовируса в культуре клеток почек обезьян получен в присутствии глюкозы и цистина [341], а в культуре клеток HeLa — при наличии в среде глюкозы и глютамина [562]. Возможно, что разные клетки могут иметь различные потребности в питании для максимального синтеза одного и того же вируса. Это также может быть связано со скоростью размножения вируса. Казалось, что чем сложнее вирусы и чем медленнее они размножаются, тем они более требовательны к питательным субстратам среды, чем мелковирионные, просто устроенные и быстро реплицирующиеся вирусы.
Добавление смеси аминокислот к раствору Хенкса увеличивало титр вирусов ньюкаслской болезни и болезни Ауески на 1,5—2,0 lg, но не оказывало влияния на накопление вируса ящура [168]. Обогащение поддерживающей среды питательными субстратами на 1,0—1,5 lg повышало выход вируса клещевого энцефалита и везикулярного стоматита. Для нормального синтеза инфекционных частиц вирусов герпеса и осповакцины необходимо присутствие в среде аргинина, а для вируса чумы собак — метионина [784]. Исключение различных аминокислот из среды Игла (МЕМ) сопровождалось различным снижением уровня накопления вируса ньюкаслской болезни. Однако синтез инфекционных вирионов полностью прекращался лишь в отсутствие в среде аргинина. При этом синтез вирусспецифических компонентов не останавливался, хотя гемадсорбция заметно подавлялась. Возможно, что аргинин играет важную роль в синтезе белка, участвующего в сборке и созревании этого вируса.
Температурные границы и температурный оптимум размножения вирусов контролируется вирусным геномом, хотя в известной степени они зависят и от клеточной системы. Принято считать, что оптимальная температура для размножения большинства вирусов 36—37°С. Однако из этого правила имеются исключения. Например, для риновирусов температурный оптимум размножения равен 33—34°С. Герпесвирус 2 крупного рогатого скота максимально накапливается в первичной культуре клеток телят при 32°С. Вирус гриппа С, в отличие от вирусов гриппа А и В, лучше размножается при 32—33°С, хотя накапливается медленнее [72]. Ряд альфавирусов накапливается в постоянной линии клеток комаров при 34,5°С в значительно большем титре, чем при оптимальной температуре, требующейся для размножения этих клеток.
Оптимальный температурный режим размножения вируса может зависеть от температуры предшествующего выращивания. Известно, например, что так называемые «холодные» варианты вирусов лучше размножаются при пониженных температурах, а оптимум размножения у аттенуированных штаммов, как правило, ниже, чем у патогенных штаммов того же вируса.
Накопление вируса в культуре зависит от множественности заражения, которая главным образом влияет на продолжительность накопления вируса, а не на его урожай. Для заражения однослойных культур с целью накопления вируса обычно применяют 0,001—0,1 ТЦД50 на одну клетку (М = 0,001—0,1). При этом
накопление вируса в культуре является суммарным результатом многоцикловой репродукции. В случаях, когда имеют дело с культурами клеток, жизнеспособность которых снижается быстро, а вирусы не обладают коротким циклом репродукции, множественность заражения имеет более важное значение. Эти культуры заражают таким образом, чтобы как можно больше клеток включить в первичный инфекционный процесс. Имеются сообщения о повышении урожая вирусов при использовании высокой множественности заражения (М= 10—100). Кроме того, использование высокой множественности заражения способствовало получению «раннего» вируса везикулярного стоматита (спустя 4,5 ч после заражения), с повышенным содержанием вирионного белка, ответственного за иммуногенную активность. Однако высокая множественность заражения в процессе серийного пассирования может привести к изменению соотношения гетерогенных частиц в вирусной популяции и, тем самым, изменить ее фенотипические свойства [1044]. В случаях, когда при высокой множественности заражения наблюдается торможение репродукции вируса за счет аутоинтерференции (феномен Магнуса), прибегают к удалению дефектных интерферирующих частиц (ДИЧ) или других ингибирующих субстанций. Применительно к безоболочеч- ным вирусам хорошие результаты получают с помощью простой обработки вирусного инокулята фреоном или хлороформом.
При медленном накоплении вируса и невозможности обеспечения высокой множественности заражения вирус часто вносят в культуру одновременно с посевом клеток.
Иногда с целью повышения выхода применяют повторные сборы вируса путем смены среды в период выраженного накопления. Этот прием особенно эффективен при культивировании постоянных клеточных линий, хронически инфицированных вирусом (например BJI КРС) и экскретирующим его в культуральную среду. Кроме сохранения зрелого внеклеточного вируса, такая операция может способствовать его репродукции за счет уменьшения концентрации ингибиторов в культуре. Заметное влияние на репродукцию вирусов оказывает pH поддерживающей среды. Так, вирус бешенства гораздо интенсивнее размножался в культуре клеток КЭ при повышении pH поддерживающей среды от 7,4 до 8,2. Как показало изучение структуры вирусной популяции, при щелочном pH не происходит накопления ДИЧ и отсутствует аутоинтерференция [1710].
Репродукция альфавирусов также заметно усиливалась при инкубации зараженных клеточных культур в щелочной среде с pH 7,5—7,9 [71]. Имеется ряд сообщений о благоприятном влиянии трипсина на размножение некоторых вирусов и проявлении их свойств. Феномен протеолитической активации хорошо известен у орто- и парамиксовирусов. Вирусы гриппа, выращенные в курином эмбрионе, обладали высокой инфекционностью. У тех же вирусов, выращенных в культуре клеток куриного эмбриона, инфекционность была на 2—3 lg ниже. Это явление связывают с протеолитическим расщеплением полипептида гемагглю- тинина (ГА). Аллантоисный вирус содержит «расщепленный» ГА (ГА1—50 кД и ГА2—30 кД), тогда как культуральный вирус - «нерасщепленный» ГА (75 кД). Ви-
рионы с нерасщепленным ГА адсорбировались, но не проникали в клетки, поскольку содержали белок (F) слияния оболочки вируса с клеточной мембраной в неактивированной, форме. Оказалось, что расщепление ГА-предшественника на фрагменты ГА1 и ГА2 могут вызывать различные протеазы, однако только расщепление трипсином и трипсиноподобными ферментами приводит к образованию высокоинфекционного вируса гриппа [894]. Обработка вируса гриппа А трипсином до заражения клеток и добавление трипсина в культуральную среду в процессе репликации повышали его инфекционность. Исключение составил вирус гриппа птиц, у которого отмечено расщепление ГА и высокая степень ин- фекционности как после размножения в эмбрионах, так и в культуре клеток. Обработка трипсином в этом случае не оказывала положительного эффекта. Вирус Сендай не продуцировал инфекционных частиц в культурах клеточных линий. Обработка инфицированных клеток трипсином восстанавливала его биологическую активность благодаря расщеплению гликопротеина F (65 кД) на две субъединицы FI (51 кД) и F2 (15 кД). Для изоляции и культивирования парамиксови- русов человека весьма эффективной оказалась линия клеток NCI-H292 при использовании поддерживающих сред с добавлением трипсина (1,5 мкг/мл) [457]. Установлено, что вирус ньюкаслской болезни содержит два предшественника гликопротеинов HNo и Fo, которые в результате протеолиза превращаются соответственно в гликопротеины HN и F. С ними связана гемолитическая, гемаг- глютинирующая, нейраминидазная и инфекционная активность вируса. Существенные различия штаммов вируса ньюкаслской болезни по патогенности определяются структурными особенностями гликопротеинов наружной оболочки вириона, которые отличаются способностью активироваться протеолитически- ми ферментами. Наличие трипсина в поддерживающей среде стимулировало репродукцию вируса осповакцины. Протеолитический процессинг вирусных гликопротеинов зависит от природы вируса, а также от клеточных факторов культуральной системы. В наибольшей степени от протеолитической активизации зависит репродукция оболочечных вирусов, клетками-мишенями которых in vivo являются энтероциты. К таким вирусам прежде всего относятся ротавирусы млекопитающих и птиц, кишечные коронавирусы свиней и некоторые аденовирусы. Классическим примером протеолитической активации могут служить ротавирусы, выделение и культивирование которых стало возможным благодаря применению трипсина. Обработка трипсином значительно способствует выделению и репродукции вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, и обеспечивает размножение в культуре клеток Vero вируса эпизоотической диареи поросят [787]. Вирус эпизоотической диареи свиней (ВЭДС) размножался в культуре клеток \fero только в присутствии трипсина (10 мкг/мл) в поддерживающей среде. ЦПЭ проявлялся образованием синцития. После ряда пассажей в клетках Vero в присутствии трипсина удалось адаптировать вирус к культурам клеток МА 104, СРК и ESK при добавлении трипсина. Попытка адаптировать вирус к шести типам первичных культур клеток эмбриона свиньи не увенчалась успехом. Использование этой, ставшей теперь рутинной, методики позволило размно
жить астровирус человека в первичной культуре клеток почки эмбриона человека и обезьян. После 11 пассажей вируса в культуре его размножение оставалось трипсинзависимым. Аналогичным образом удалось адаптировать астровирус крупного рогатого скота (штамм US2, серотипа 2) к размножению в культуре клеток новорожденного теленка. Вирус размножался в серийных пассажах только в присутствии трипсина. На ранних пассажах вирус накапливался в культуральной среде через семь суток, а в последующем — через трое. Количество инфицированных клеток в культуре было невысоким и не превышало 10—20%. Значение штамма, клеточного субстрата и протеолитической активации в репродукции вирусов можно проследить на примере ротавирусов птиц и кишечных аденовирусов человека. Ротавирус птиц с трудом культивируется в присутствии трипсина, вызывая ЦПЭ в культуре клеток печени и почек КЭ. После трех пассажей вирус терялся в культуре клеток печени, но полностью адаптировался к клеткам почек. После шести пассажей вирус приобрел способность реплицироваться без обработки трипсином, а после 10 пассажей в почечных клетках — легко культивировался в печеночных клетках и фибробластах КЭ. Однако размножение ротавируса сопровождалось ЦПЭ только в культуре почечных клеток КЭ. Протеолитическая активация была необходима для выделения и репродукции в культуре клеток КВ только некоторых серотипов кишечных аденовирусов человека. Добавление трипсина повышало выход инфекционного вируса гриппа С [72]. Имеются и другие сообщения о том, что обработка клеток трипсином благоприятно сказывается на размножении ряда вирусов.
Протеолитическая активация вирусов тесно примыкает к проблеме зависимой от хозяина модификации вирусных полипептидов. Репродукция вируса Сендай зависела от длительности субкультивирования клеток почки обезьян. Первичная и вторичная культуры поддерживали многоцикловую репродукцию вируса. После нескольких субкультивирований клетки теряли эту способность, что коррелировало со снижением протеолитического расщепления поверхностного гликопротеида вируса (Fo) за счет снижения (потери) трипсиноподобной активности клеток. Многоцикловая репродукция вируса в таких клетках вос- ставнавливалась при внесении в культуральную среду трипсина (0,3 мкг/мл). Причина снижения протеолитической активности клеток при субкультивировании не выяснена. Относительное содержание гликопротеинов (62 и 71 кД) оболочки вируса краснухи зависело от типа клеток, использованных для его выращивания, что, по мнению авторов, связано с различным уровнем активности клеточных протеаз. Степень стимуляции репродукции коронавируса крупного рогатого скота трипсином была различной в разных культурах и наименее интенсивной в постоянной линии клеток ректальной опухоли человека (НРТ-18), в которой вирус мог размножаться и при отсутствии трипсина [554]. В его присутствии коронавирус свиней накапливался в высоком титре (108—109 ТЦД50/мл) в двух постоянных линиях клеток свиней (СПЭВ и ППС). Однако только вирус, размноженный в одной из них (ППС), обладал гемагглю- тинирующей активностью (ГА), не влияющей на иммуногенность. Вирус инфек
ционного ларинготрахеита кур, выращенный в первичной культуре клеток почки цыплят, имел гемагглютинирующую активность, выделяемую в РТГА с эритроцитами мышей, но не других видов животных. Тот же вирус, размноженный в куриных эмбрионах, обладал ГА-активностью. Эти данные свидетельствуют о важных хозяинных различиях эндогенного процессинга гликопротеинов вируса, не связанных с его инфекционностью или иммуногенностью.
Таким образом, протеолитический процессинг вирионных полипротеинов имеет место у представителей многих семейств вирусов. В нем принимают участие вирусспецифические и клеточные протеазы. Можно предположить, что все вирусы в процессинге протеинов, в которых принимают участие протеазы клеток, должны усиливать репродукцию в присутствии трипсина в ростовой среде. Степень усиливающего эффекта при этом будет находиться в обратной зависимости от протеолитической активности внутриклеточных ферментов данной культуральной системы.
Для выявления вируса классической чумы свиней, размножающегося в культурах клеток без ЦПЭ и нецитопатогенных штаммов вируса диареи крупного рогатого скота, использовали стимуляцию ими репликации вируса ньюкаслской болезни.
Скорость накопления вирусов болезней Марека или Гамборо изучали при раздельном и смешанном инфицировании культуры клеток куриного эмбриона. Максимальный урожай обоих вирусов отмечали при внесении вируса болезни Гамборо через 2-3 дня после инфицирования вирусом болезни Марека. Такой вирус использовали для изготовления асс