Разработку субъединичных вакцин начали в связи с необходимостью повышения эффективности инактивированной вакцины против гриппа человека. Такие вакцины обычно содержат очищенные или частично очищенные вирусные
белки, выделенные после разрушения вирионов. Наибольший успех в выделении антигенноактивных компонентов достигнут в работе с оболочечными вирусами.
Жирорастворители, такие как деоксихолат натрия, используют для разрушения оболочечных вирусов (вирионов) с целью освобождения их компонентов, включая гликопротеины пепломеров оболочки. Для частичной очистки этих гликопротеинов применяют дифференциальное центрифугирование, затем их используют для изготовления так называемой расщепленной «split» вакцины. Примером таких вакцин являются вакцины против вирусов герпеса, гриппа и коронавирусов.
В медицинской практике применяли две субъединичные вакцины: против гриппа, содержащую гемагглютинин, выделенный после разрушения вируса, размноженного в куриных эмбрионах; против гепатита В, содержащую антиген из плазмы крови вирусоносителей. Хотя последняя обладала протективными свойствами, ее высокая стоимость и актуальность задачи побудили разработать рекомбинантную субъединичную вакцину, особенно после того, как экспрессия HBsAg в эукариотических системах была успешной.
Расщепленные вакцины, как правило, готовят из поверхностных структур (капсидов, суперкапсидов и клеточных мембран), содержащих протективные антигены. Они вызывают образование специфических антител и цитотоксических лимфоцитов. Хотя в основном иммунитет вызывают белки поверхности вирионов, другие вирусные белки также являются мишенями для иммунной системы.
При некоторых вирусных инфекциях (герпес-, ретровирусы и др.) протективные антигены могут быть связаны с поверхностью инфицированных клеток и быть вирусспецифическими невирионными компонентами.
Приготовление расщепленных вакцин включает в себя ряд основных этапов: получение вирусного сырья, выделение и очистка протективных вирусных компонентов и приготовление вакцинного препарата.
Для получения исходного вирусного материала используют те же методы культивирования вирусов, что при изготовлении инактивированных вакцин.
Для дезинтеграции вирусных частиц могут быть использованы протеолити- ческие и липолитичесике ферменты, органические растворители, щелочи, детергенты. Органические растворители разрушают мембранные структуры и освобождают гликопротеины вирусной оболочки [17].
Другая цель дезинтеграции вирионной структуры состоит в удалении либо инактивации вирусного генома [1131]. Обработка протеазами сопровождается расщеплением полипептидной части гликопротеина по крайней мере в одной позиции, что приводит к потере участка молекулы, погруженного в липидный бислой (гидрофобного домена), и к снижению иммуногенной активности гликопротеина.
Наиболее подходящими агентами для освобождения вирусных гликопротеинов оказались детергенты. Из неионных детергентов для получения вирусных гликопротеинов чаще всего применяют тритон X-100 и нонидет Р-40. Они обладают сравнительно мягким действием и не повреждают субъединиц. С их помо-
Щью получены гликопротеины вирусов гриппа, парагриппа, бешенства, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, леса Семлики и многих представителей герпесвирусов [17,114].
Обработка вируса гриппа детергентом тритон N-101 позволила выделить субъединицы интактными [141]. В водных суспензиях «палочки» гемагглютини- на прикрепляются друг к другу с помощью «липких» концов, которые первоначально были погружены в липидную мембрану вириона. Нейраминидазные субъединицы с лукообразными концевыми утолщениями также агрегируют между собой. Эта способность образовывать агрегаты оказалась критической для сохранения антигенности и получения эффективной вакцины.
Очистку вирусных субъединиц в основном проводят гельфильтрацией или скоростным центрифугированием [17]. Простейший метод отделения субъединиц от нежелательных остатков вирусов — адсорбция на гидрате окиси алюминия при необходимом значении pH. Надосадочную жидкость после центрифугирования удаляют, а гидроокись алюминия с адсорбированными субъединицами ресуспендируют в нужном разбавителе. Недостаток данного метода заключается в том, что субъединицы находятся не в свободном виде и это затрудняет точный количественный анализ антигена, а также стандартизацию продукта [163].
Субъединичные вакцины против гриппа были первыми высокоочищенными вакцинами для практического применения и, по-видимому, — наиболее важным примером практического применения гликопротеинов вообще.
Данные относительно эффективности применения таких (расщепленных) вакцин были нередко противоречивы.
При разработке субъединичной гриппозной вакцины преследовали цель, чтобы она имела такую же иммуногенность, как и обычная вакцина из цельного вируса, но была бы менее реактогенна. Результаты сравнительных испытаний вакцин двух видов показали, что поставленная цель может быть достигнута [17, 114, 1131].
Очищенная субъединичная вакцина против гриппа А и В («грипповак») оказалась достаточно эффективным препаратом в группах высокого риска. Экспериментальная вакцина с адъювантом обладала высокой иммуногенностью для мышей при подкожном и интраназальном применении [982] и отличалась выраженным синтезом секреторного IgA и развитием более напряженного иммунитета [632]. Иммунизация гликопротеинами вируса простого герпеса сопровождалась специфическим гумморальным и клеточным ответом. Субъединичная герпетическая вакцина была не менее эффективна в защите от последующего заражения вирусом герпеса, чем живая или инактивированная цельновирионная вакцина [163].
Одна иммунизирующая доза вакцины содержала 10- 40 мкг очищенного антигена вируса простого герпеса типа 1 и 2 и 1 мг гидрата окиси алюминия. Вакцина из гликопротеина-D вируса простого герпеса защищала мышей и морских свинок при инфицировании их вирулентным штаммом, а также индуцировала гуморальный и клеточный ответ у обезьян и грызунов [836].
, Jn содержащая мембранный гликопротеин вируса Эпштейна-Барр (gp-340) и мурамилдипептид, вызывала у обезьян индукцию антител к gn-340 определяемых в ИФА и в реакции нейтрализации. У иммунизированных животных, зараженных 100%-ной канцерогенной дозой вируса, отмечали резкое снижение количества мононуклеарных инфицированных клеток и отсутствие опухолей [1097].
Экспериментальную вакцину против болезни Ауески готовили из мембран инфицированных клеток РК-15. Клетки собирали через 16 ч после инфицирования до развития выраженного ЦПЭ (ЗхЮ7 в 1 мл). Эффективность субъединич- ной и инактивированной цельновирионной вакцины сравнивали на свиньях. У свиней, привитых дважды субъединичной вакциной, гуморальный, клеточный и протективный иммунитет были более выраженными, чем у привитых инактивированной вакциной. Эти результаты позволили разработать промышленную технологию изготовления вакцины и наладить ее производство. Основные этапы этого процесса выглядят следующим образом. Делеционный штамм КаН вируса БА размножали в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в ферментерах объемом 100—2800 л и инактивировали этиленимином. Осветленную очищенную и концентрированную ультрафильтрацией вируссодержащую суспензию с целью разрушения вирионов и освобождения гликопротеинов обрабатывали полио- ксиэтиленовым спиртом, а гликопротеины осаждали ультрацентрифугированием. Суспензию очищенных вирусных гликопротеинов (10 мг/доза) эмульгировали в минеральном масле. Отсутствие в вакцинном штамме КаН gpl, gp63, так же как и удаление капсидных белков в процессе приготовления субъединичной вакцины, существенно не отражалось на ее иммуногенности по сравнению с цель- новирионными препаратами. Однако, в отличие от них, субъединичная вакцина давала возможность по антителам различать вакцинированных и инфицированных животных [169].
Субъединичную вакцину против герпесвирусной инфекции КРС готовили из вирулентного вируса типа 4. Телята, иммунизированные внутримышечно дважды ИСКОМ-вакциной (50 и 100 мкг вирусных антигенов), имели высокий титр В НА (1:3500) и не заболели при контрольном заражении [1063].
Гликопротеины вируса инфекционного ларинготрахеита кур выделяли из экстрактов вирусинфицированных клеток и очищали с помощью лектин-аф- финной хроматографии. Препаратами, содержащими вирусные гликопротеины (205, 160, 115, 90, 85, 74, 60 и 50 кД), вакцинировали цыплят. Гликопротеины предохраняли 83% птицы от инфицирования патогенным вирусом, о чем также свидетельствовало отсутствие вирусного антигена в трахее инфицированных цыплят. Формирование вируснейтрализующих антител не коррелировало с напряженностью иммунитета у вакцинированной птицы [1709].
ИСКОМ герпесвируса лошадей тип 1 содержал все основные гликопротеины в соотношениях, аналогичных их содержанию в интактном неразрушенном вирусе. Иммунизация вызывала у хомяков антительный ответ к индивидуальным вирусным гликопротеинам и полипептидам. Хомяки, вакцинированные
двукратно с интервалом 6 недель, были полностью защищены от заражения 100 ЛД50 герпесвируса-1 лошадей [553].
Определенные успехи достигнуты в создании субъединичных вакцин против парамиксовирусных инфекций человека и животных. ИСКОМ, приготовленный на основе мембранных Н- и F-белков, вируса кори, выделенного из лизатов инфицированных клеток Vero, вызывал образование нейтрализующих и протек- тивных антител, специфичных к Н-и F-антигенам у мышей, крыс, кроликов, обезьян и собак. ИСКОМ, содержащий лишь F-антиген, не вызывал у животных формирования нейтрализующих антител и антигемагглютининов, но индуцировал антитела, идентифицируемые в ИФА тестами ингибирования гемадсорбции F-антигенами либо вызываемого им сплавления. Оба комплекса вызывали Т- клеточный ответ и защиту мышей от летального интрацеребрального заражения вирусом кори. Для развития полноценного иммунитета против кори вакцина должна содержать обе субъединицы вируса.
ИСКОМ, содержащий F- и Н-антигены вируса чумы плотоядных, вызывал у привитых собак образование вируснейтрализующих антител и развитие иммунитета. Этот препарат также защищал тюленей от патогенного для них морбил- ливируса. ИСКОМ, содержащий белки F- и Н-вируса кори, создавал частичную защиту у собак к вирусу чумы плотоядных. В этом отношении живая коревая вакцина была более эффективной [1166].
Гликопротеиновый гемагглютинин-нейраминидазный комплекс вируса ньюкаслской болезни (штамм Ла-Сота) обнаружил выраженную антигенную активностью при испытании на курах.
Смесь гликопротеинов F; G и матриксного белка М респираторно-синцитиального вируса использовали для иммунизации мышей. Иммунитет проверяли интраназальным заражением мышей вирулентным штаммом вируса. Вакцину, содержащую различное количество вирусного антигена, вводили подкожно с полным адъювантом Фрейнда 1—3 раза. В дозе 5 мкг вакцина не защищала мышей, тогда как в дозе 25 мкг у 93% зараженных мышей не отмечено легочных поражений, хотя у них после вакцинации не обнаружено вируснейтрализующих антител. Выявлялись только антитела к F-, G- и М-белкам в других реакциях. Вируснейтрализующие антитела появлялись только у мышей, вакцинированных двукратно в дозе 50 мкг каждого компонента. При этом все животные были полностью резистентны к заражению. Защитным эффектом обладали антитела к белкам F и G, но не к М-белку [945]. Субъединичную вакцину против РС-ин- фекции готовили из концентрированного вируса, разрушенного мягкими детергентами. Белки F, G и М очищали сорбцией на ионообменнике с последующей элюцией. Полученный препарат обладал выраженной иммуногенностью [459].
Экспериментальные иммуностимулирующие комплексы, содержащие субъединицы оболочки вируса краснухи, были испытаны на кроликах. Оказалось, что такая вакцина по антигенности и индукции нейтрализующих антител и антигемагглютининов, не отличается от живой вакцины [1542]. Она вызывала защитный иммунитет у обезьян даже в присутствии пассивных антител [1568].
Гликопротеины пепломеров коронавируса гепатита мышей в дозе 1 мкг с адъювантом Фрейнда защищали мышей от развития летального энцефалита при заражении (10 ЛД50) гомологичным вирусом [560].
Гликопротеиновый комплекс вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней выделяли из вирионов с помощью ультразвука и отделяли от остальных вирусных компонентов с помощью изопикнического центрифугирования. Субъе- диничный препарат при внутримышечном введении в дозе 1 мкг гликопротеинов защищал поросят при заражении вирулентным штаммом вируса. У вакцинированных поросят развивался гуморальный иммунный ответ.
Гликопротеин G оболочки вируса бешенства — единственный белок, ответственный за индукцию вируснейтрализующих антител и формирование проективного иммунитета. Высокоочищенные препараты гликопротеина получали при обработке вируса бешенства нонидетом Р-40, три-п-бутилфосфатом или бромелином. Препараты очищенного гликопротеина G вызывали образование нейтрализующих антител у кроликов и защищали мышей от летальной инфекции при интрацеребральном введении вирулентного вируса.
Развитие протективного иммунитета при иммунизации очищенным белком G происходило медленнее, чем при введении цельного вируса бешенства, хотя степень защиты от летальной инфекции была одинаковой для обоих препаратов [17]. В отличие от цельных вирионов, субвирионный препарат не обладал гемаг- глютинирующей активностью [163].
Исследования с вирусом везикулярного стоматита показали, что при обработке вирионов трипсином разрушается их способность инцудировать образование нейтрализующих антител. Иммунизирующий антиген может быть извлечен из вируса посредством обработки его твином или нонидетом Р-40, либо дезокси- холатом натрия [163].
Однократная иммунизация гликопротеинами поверхности вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей защищала 70% мышей от летальной инфекции вирулентным штаммом, а двукратная иммунизация гликопротеинами обеспечивала 100%-ную защиту от заражения. Субъединичная вакцина, приготовленная из очищенных гликопротеинов вируса клещевого энцефалита, была сравнима по иммуногенности и протективным свойствам с цельновирионной формолвакциной [17].
Вакцина из гликопротеина Е вируса японского энцефалита по иммуногенности уступала цельновирионной инактивированной вакцине.
Субъединичные вакцины привлекли внимание исследователей, занимающихся специфической профилактикой лейкоза кошек. Вакцинация кошек с последующей ревакцинацией субъединичной вакциной против лейкоза кошек (Leucocell), включающей антигены подтипов А, В и С и мембранный антиген онкорнавируса кошек, защищает животных от развития инфекции при последующем заражении их вирулентным штаммом вируса лейкоза кошек. Спустя 2—4 года после вакцинации и заражения еженедельная инъекция животным метил- преднизалона (7,5 мг/кг) не вела к реактивации вируса в культуре клеток костно
го мозга. Указанная вакцина предотвращала латентную инфекцию вирусом лейкоза кошек даже на фоне иммуносупрессии. Она хорошо защищает кошек от персистентной виремии и возникновения опухолей. Кошек иммунизировали иммуностимулирующим комплексом, приготовленным на базе оболочечного гликопротеина вируса лейкоза кошек gp70 и трансмембранного белка вируса р15Е, или коммерческой субъединичной вакциной из вируса лейкоза кошек Leucocell. Оба препарата содержали сопоставимые количества белка gp70. Животных иммунизировали трижды и наблюдали в течение 200 дней. За этот период животные оставались здоровыми, а попытки выделить от них вирус были безуспешными. По сравнению с коммерческой вакциной, вакцина на основе ИСКОМ во всех случаях индуцировала сероконверсию и более высокие титры антител, выявляемых ИФА, или в нейтрализации. Методом иммуноблоттинга подтверждено формирование специфических антител, реагирующих с белками gp70 и Р15Е [1188].
Флавивирусные инфекции сопровождаются образованием антител как к структурным, так и к ассоциированным с клетками вирусспецифическим неструктурным белкам; К последним относится gp48, известный как N51 -белок — большой комплементсвязывающий антиген, существующий либо в связанном с клетками виде, либо в растворимой форме.
Очищенный белок NS1 вируса желтой лихорадки получали из лизатов инфицированных клеток Vero методом аффинной хроматографии с использованием в качестве лиганда анти-NSl моноклональных антител. Интраперитониальное введение мышам 15 мкг N S1 дважды с интервалом две недели вызывало образование антител и создавало 100%-ную защиту животных от внутрикожного заражения летальной дозой вируса.
Иммунизация обезьян резус NS 1-белком дважды (100 мкг внутрикожно и 500 мкг подкожно) вела к появлению в крови антител в титре 1:64 — 1:256 и NSl-ан- тител и предотвращала летальный исход после заражения вирулентным штаммом вируса желтой лихорадки. Механизм защитного эффекта NS1-белка обусловлен комплементопосредственным иммунным цитолизом клеток, несущих поверхностный NS1-антиген. Этот механизм защиты возможен и у других флавирусов. Иммуногенность очищенного структурного Е-белка (33 кД) вируса желтой лихорадки оказалась менее выраженной [386]. Интересным продолжением описанных примеров может служить получение субъединиц из безоболочечных вирусов и использование соответствующих препаратов для вакцинации. Субъединичные вакцины, содержащие очищенные гексоны аденовируса типа-5, обладали выраженной антигенностью и оказались нереактогенными для людей [163].
Субъединичную (VP 1) и цельновирионную инактивированную вакцины против ящура оценивали на морских свинках. Для создания одинакового эффекта в субъединичной вакцине, должно содержаться значительно больше антигена, чем в цельновирионной. Заключенный в липосомы вирионный белок (VP 1) или цельные инкативированные вирионы обладали большей антигенностью, чем те же иммуногены с полным адъювантом Фрейнда [169].
Субъединичная вакцина, содержащая капсидные белки VP1, 2, 3 и, по-видимому, VP4 вируса энцефаломиокардита в дозе gt;16 нг, защищала мышей от гибели при экспериментальном заражении [672].
Белок Р-2 вируса катаральной лихорадки овец в препаративных количествах выделяли обработкой вирионов моновалентными или двухвалентными солями. При такой обработке сохранялись иммунологическая специфичность Р-2. 50 мкг белка Р-2 было достаточно для индукции у овец преципитирующих и нейтрализующих антител. Вакцинированные белком Р-2 овцы оказались защищенными против вирулентного штамма вируса [822]. Однако неясно, почему пустые капсиды ротавируса крупного рогатого скота, содержащие иммунодоминантный белок VP7, были неспособны к индукции вируснейтрализующих антител у крупного рогатого скота.
Субъединичная (плазменная) вакцина против гепатита В после трехкратного введения вызывала образование защитного уровеня анти- Н Bs-антител у 87—95% вакцинированных. В дальнейшем эта вакцина была заменена рекомбинантной субъединичной вакциной, HBsAg для которой синтезирован в дрожжах.
Приведенные выше примеры позволили идентифицировать протективные вирусные антигены и показали, что субъединичные вакцины обладают выраженной иммуногенностью. Результаты таких исследований явились хорошим обоснованием и предпосылкой для разработки субъединичных (компонентных) вакцин на основе рекомбинантной технологии.
Считается, что важное значение в обеспечении высокой иммуногенности гликопротеинов играет форма их надмолекулярной организации в препарате. Согласно этой точке зрения, мицеллярные формы белков обладают повышенной иммуногенностью, тогда как мономерные формы белков не способны стимулировать образование высокого уровня иммунитета.
Только крупные антигенные комплексы способны вызывать иммунный ответ, сопоставимый с индуцированным цельным вирусом. Таким образом, технология приготовления эффективных субъединичных вакцин должна предусматривать образование мультимерных агрегатов («мицелл», «розеток»).
Альтернативным способом повышения иммуногенной активности изолированных гликопротеинов может служить встраивание в липосомы. Иммуностимулирующие свойства липосом описаны для многих секретируемых и трансмембранных белков и подтверждены на ряде субъединичных вакцин. Реконструкция трансмембранных белков в липосомы, по-видимому, в наибольшей степени приближает их структуру к естественной. Липосомы и мицеллы гликопротеинов одинаково эффективно связываются с клеточной поверхностью и, вероятно, одинаково доступны для взаимодействия с клетками иммунной системы.
В некоторых сообщениях отмечается относительная слабость субъединичных вакцин в индукции клеточного, а также гетеротипического иммунитета по сравнению с инактивированными цельновирионными и живыми вакцинами. Для усиления иммуногенной активности вирусных компонентов используют
адъюванты: масляные адъюванты, адсорбенты, мурамилдипептид и его производные и иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМ).
Одной из главных проблем производства субъединичных вакцин является источник вирусных компонентов. Облегчить решение этой задачи может применение суспензионного метода культивирования вирусов в постоянных линиях клеток или нетрадиционных методов наработки вирусных антигенов.
Вне зависимости от того, появятся или не появятся какие-либо выгоды от использования традиционных субъединичных препаратов, необходимость создания высокоочищенных эффективных компонентных вакцин хотя бы против некоторых заболеваний отдельных категорий людей, по-видимому, останется актуальной задачей.
Высокая степень очистки субъединичных вакцин дает возможность стандартизировать содержание вирусного антигена в прививной дозе и отказаться от недостаточно точных громоздких и дорогостоящих биологических методов контроля иммуногенности. Например, согласно рекомендации Комитета экспертов ВОЗ по гриппу, качество вакцины против гриппа определяли по концентрации гетмаглютинина методом радиальной иммунодиффузии [1379].
Хорошо известным и широко апробированным методом оценки иммуногенности инактивированной противоящурной вакцины является определение концентрации полных вирионов (146S частиц). Этот метод применяют для оценки специфической активности вакцины на различных этапах технологического цикла ее изготовления [1190]. Контроль вакцины по количественному содержанию вируса (175S частицы) проводят при изготовлении инактивированной вакцины против геморрагической болезни кроликов [961]. Для оценки качества инактивированной вакцины против гепатита А предложено количественное определение содержания вирусного антигена в готовом препарате [334].
Концентрацию вирусного антигена при изготовлении инактивированных вакцин против клещевого энцефалита [187], простого герпеса типа 1 и 2, болезни Гамборо определяют в ИФА. Этот метод выявления вирусного гликопротеина обнаружил высокую степень корреляции с биологическим методом контроля иммуногенности инактивированных вакцин против бешенства человека и животных [301].